电化学免疫传感器测定牛奶中的青霉素（论文）

1、化学通报在线预览版电化学免疫传感器测定牛奶中的青霉素武 海 a杨维春 a 马 洁* b(a 平顶山学院化学化工学院 平顶山 467002; b 首都师范大学化学系 北京 100037)摘 要 利用共价键合法, 将新亚甲蓝(NMB)与辣根过氧化酶 (HRP) 标记的青霉素多克隆抗体 (Ab*) 修饰于玻碳电极 表面, 制成电流型免疫传感器；考察了该传感器的电化学行为、对 H2O2 的电化学响应。结果表明，NMB 作为介体能有 效地传递电子, 传感器对 H2O2 具有很好的催化作用。用此传感器对牛奶中的青霉素进行检测, 其线性范围为 0.253.00 ng/mL

2、 (R0.984), 检出限为 0.298 ng/mL。关键词 免疫传感器 新亚甲蓝 共价键合 青霉素Determination of Penicillin in Milk by the Electrochemical ImmunosensorWu Hai a,Yang Weichuna, Ma Jie * b( aCollege of Chemistry and Chemical Engineering, Pingdingshan University, Pingdingshan 467002;bDepartment of Chemistry, Capital Normal Universi

3、ty, Beijing 100037)Abstract An amperometric immunosensor was fabricated by co-immobilizing new methylene blue (NMB) and Horseradish Peroxidase (HRP)-labeled penicillin polyclonal antibody (Ab*) on a glassy carbon electrode through covalent immobilization. The electrochemical behaviors, the response

4、on hydrogen peroxide of the immunosensor had been investigated. The resultsshowed that the NMB enhanced the electron transfer between HRP and electrode and the sensor exhibited excellent catalytic activity to H2O2. The linear dependence of current on penicillin concentration in milk was in the range

5、 of 0.253.00 ng/mL with the correlation coefficient of 0.984 , the detection limit was 0.298 ng/mL.Keywords Immunosensor, New methylene blue, Covalently bonding, Penicillin青霉素和一些 -内酰胺类青霉素是抗菌性药物, 主要通过内服或外用来防治奶牛乳腺炎病。然而， 牛奶中抗生素残留超标对人体健康会造成很大的危害, 长期饮用抗生素残留超标的牛奶, 会增加人体内 细菌的耐药性, 一旦人体患病时, 往往由于耐药性菌株的存在而使治疗失

6、败。所以对牛奶中的青霉素残 留的检测非常重要。目前常用的检测方法有: 微生物法1,2、高效液相色谱法3、气相色谱法4、免疫检 测法5等。近年来, 免疫检测法发展较快, 如酶联免疫吸附法6、荧光免疫7、放射免疫分析8 等等。这 些方法能够较好地对牛奶中青霉素残留进行检测, 然而由于价格昂贵或步骤复杂或条件要求苛刻，其发 展和应用受到了限制。电化学免疫传感器法是利用抗原和抗体间的高度特异性结合, 将免疫测试方法与 近代生物传感技术融为一体, 既具有免疫反应的高选择性又兼有电化学分析的高灵敏性, 已在医疗卫 生、环境等领域得到广泛应用9。电流型电化学免疫传感器是利用抗原抗体反应的特异性,通过具有电活

7、北京市自然科学基金项目(6052002 )资助 2007-09-19 收稿，2008-01-03 接受性的介体将免疫反应转换为电流信号, 从而对抗原或抗体进行检测的一种装置。 新亚甲蓝具有共轭的平面结构, 是一种比较活泼的电子转移体, 具有良好的电化学活性，其作为介体应用于生物传感器的研究已有报道10, 但因其响应电流较小, 影响检测的准确性。共价键合法可以实 现介体在电极上的直接固定, 而且稳定性和重现性高。在笔者已经发表的电流型过氧化氢生物传感器11 的基础上，本文通过共价键合法将介体 NMB 与 HRP 标记的青霉素抗体共价键合到玻碳电极表面, 制成 了电流型免疫传感器, 并对其电化学性

8、质及影响因素进行了研究。该方法具有操作简易、响应快、灵敏 度高、稳定性和重现性好等优点。1 实验部分1.1 仪器与试剂本文所用仪器与前文11相同, 文中电位均相对于 SCE。磷酸缓冲溶液 (KH2PO4-Na2HPO4，PBS); 对苯二甲醛 (北京化学试剂公司); 新亚甲蓝 (Aldrich 公 司); 青霉素多克隆抗体 (Ab*) (由北京大学化学系提供); 青霉素 (鼎国公司, 进口分装); 明胶 (鼎国公 司); 无抗生素牛奶 (市场购买); H2O2 (30%, 北京北化精细化学品责任有限公司); 所有实验用水均为超 纯水。1.2 NMB/ Ab*/GCE 青霉素免疫传感器与标准溶液

9、的制备11方法同前文11。具体是，将经过预处理的电极12在质量分数为 10%的对苯二甲醛溶液中浸泡 12 h, 取出, 用超纯水冲洗掉物理吸附的对苯二甲醛, 氮气吹干。然后将其浸泡在 30 L 0.20 mmol/L 的 NMB 和 30 L 5.0 mmol/L Ab*的混合溶液中 5 h, 取出, 浸入 5%的明胶溶液中 30 min 以封闭活性位点，制得 了 NMB/ Ab*/GCE 青霉素传感器。用超纯水冲洗干净, 悬置于 4的磷酸缓冲溶液上方保存待用。在牛奶样品中加入适量硫酸铵，于 4以 8000 r/min 离心 30 min，滤取其上清液。用磷酸缓冲溶液 (0.010 mol/L

10、, pH 7.0)配制成 100.00 ng/mL 的青霉素溶液, 取不同体积的青霉素溶液加入到上述牛奶上清 液中, 混匀即可得到牛奶标准溶液, 4下保存待用。1.3 实验方法将制备的传感器用超纯水冲洗干净, 氮气吹干, 恒温 37下悬置于 30 L 的青霉素牛奶标准液中 40 min 后, 充分冲洗干净, 在含 3.0 mmol/L 的 H2O2 的 0.10 mol/L PBS (pH 7.0)中进行循环伏安特性测试。2 结果与讨论2.1 青霉素传感器的电化学行为图 1 是在不同扫描速度下在 PBS 中的修饰电极的循环伏安图。由图 1 可知, 峰电流之比 ipa/ipc1, 峰 电位在低扫

11、速下基本不随扫速的改变而改变, Ep 约为 36 mV, 说明新亚甲蓝的电极反应为两电子反应, 且可逆性较好13。氧化和还原峰电流在低扫速下(20100 mV/s)与扫速成正比(见图 1 插图), 相关系数 为 0.999, 这表明电极反应呈现表面波性质而非扩散控制过程。60300-3020406080v/mV s-160I/mA4530I/mA150-15-300.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6E/V(vs. SCE)图 1 传感器在 PBS 中不同扫速的 CV 图及峰电流与扫速的关系图Fig.1 Cyclic voltammograms of immunosens

12、or in 0.10 mol/L PBS (pH=7.0) at different scan rates, inset:Plot of peak currnt vs scan rate从内至外扫速依次为: 20, 30, 40, 50, 60, 80 mV/s2.2 传感器对 H2O2 及青霉素抗原的响应图2是传感器在PBS溶液中对H2O2和青霉素的响应。曲线a是传感器在空白的PBS溶液中的CV图, 当 PBS溶液中含有3.0 mmol/L的H2O2时(曲线b), 还原峰电流增加, 而氧化峰电流减小, 这是由于标记在抗 体上的HRP对H2O2的还原有催化作用。曲线c是传感器在PBS中, 恒温

13、37.5 下浸泡40 min后, 对同样浓 度的H2O2的响应, 可以看出峰电流没有明显的改变, 说明PBS溶液对传感器无影响且重现性好。而在含 有10.00 ng/mL青霉素的PBS标准液中, 由于溶液中的青霉素与电极表面修饰的青霉素抗体形成抗原-抗 体复合物, 从而阻止了电子的传输, 导致同样条件下的还原峰电流(曲线d)明显下降。由此说明，该传感 器对青霉素具有免疫性响应。同样, 在牛奶标准溶液中也得到类似的结论。4030I/mA20100-10-20bcda0.0-0.2-0.4-0.6E/V图 2 传感器对H2O2及青霉素的响应Fig.2 The responses of immuno

14、sensor for H2O2 and penicillin(a) PBS (pH 7.0); (b) PBS (pH 7.0)+ 3.0 mmol/L H2O2; (c) PBS (pH 7.0) , 37.5,40min +3.0 mmol/L H2O2 (d) PBS (pH 7.0)+ 3.0 mmol/L H2O2+10.00 ng/mL penicillin , 37.5,40min扫速:50 mV/s2.3 传感器检测牛奶中青霉素的工作曲线由于牛奶中的青霉素抗原与电极表面的青霉素抗体形成抗原-抗体复合物, 阻碍了电子的传输, 使 得循环伏安曲线的还原峰电流下降, 以还原峰电流值对

15、青霉素浓度作图, 可得工作曲线, 从而可以对青 霉素进行定量检测。图3是传感器检测牛奶中青霉素标准溶液的工作曲线, 由图可以看出在一定范围内, 工作曲线呈现两个线性范围, 在0.253.00 ng/mL范围内灵敏度较高(见图3插图), 线性方程为: I (A) 40.58 2.721C (ng/mL) (R=0.984), 检出限为: 0.298 ng/mL。但此线性范围较窄, 这可能是由于电极面积 小、抗体固载量小、牛奶中干扰因素多, 而且形成的抗原-抗体复合物可能阻碍了抗原与抗体进一步复 合的速度, 从而在高浓度范围内灵敏度降低。42403836343201234C/(ng/mL)44I/

16、mA40I/mA36322805 10 15 20 25 30C/(ng/mL)图3 免疫传感器的工作曲线Fig. 3 The decrease of reductive peak current with increase of penicillin concentrations in milk in the range of 0.0030.00 ng/mL. Inset: linear relationship between reductive peak current and concentration of penicillin in ranges of 0.253.00 ng/mL

17、2.4 影响传感器响应的因素2.4.1 pH的影响 在含有3.0 mmol/L H2O2的PBS中, 传感器的电流响应随缓冲溶液的pH的变化而变化, 在pH=7.07.5范围内响应最大，当pH7.5时, 电流响应逐渐下降。这与HRP在中性和偏碱性中酶活性最 大是一致的。2.4.2 温度的影响 实验温度也影响着HRP的活性及HRP对H2O2还原的催化。在2055 范围内, 随温 度的升高,传感器对相同浓度的H2O2的电流响应增大, 在2540 范围内, 灵敏度较大。当继续升温(温 度高于40 )时, 由于酶部分失活而使灵敏度下降, 而且55 后电流呈下降趋势, 这可能是由于温度太 高使得蛋白部分

18、变性而引起的。为了研究方便, 本实验体系的温度均为当时室温。2.5 重现性与稳定性分别采用一批制备的5支电极测同一浓度的青霉素标液及同一支电极测不同浓度的青霉素标液，考 察了传感器的重现性。结果表明，传感器的分析间相对标准偏差小于9.9 %, 分析内相对标准偏差小于 5.8 %，传感器的重现性较好地满足了免疫分析的要求。另外，将制得的免疫传感器密封悬置于4的磷酸缓冲溶液的上方, 保持表面抗体及HRP的生物活 性, 15d后其对3.0 mmol/L的H2O2的响应仅降低了3.2, 表明传感器的稳定性较好。3 结论本文利用共价键合法将新亚甲蓝和抗体修饰于电极表面制备成的电流型电化学免疫传感器, 对

19、牛奶 中的青霉素具有良好的响应。该传感器具有稳定性强、灵敏度高、检出限低等优点。但是牛奶中干扰因 素较多, 而且青霉素抗体是多克隆抗体，其特异性免疫反应受到限制, 因而也限制了该传感器的检出线 性范围, 优化工作如共价键合时间、孵育时间、活性位点的封闭、H2O2 浓度的选择等有待进一步优化。参考文献 1 A Montero, R L Althaus, A Molina et al. Small Ruminant Res., 2005, 57:229237. 2 J B Lee, H H Chung, Y H Chung et al. Food Chem., 2007, 105 :17261731.3 L K Srensen, L K Snor, T Elkr et al. J. Chromatography B, 1999, 734: 307318. 4 M Yang, A T Sterling. J. Chromatography A. 2001, 939:5967.5 E Gustavsson, P Bjurling, se Sternesj. Ana