遗传学专业毕业论文[精品论文]人胚胎干细胞体内分化途径获取神经干细胞及DNA甲基化酶Dnmt3a和Dnmt3b表达下调对人胚胎干细胞的影响

1、遗传学专业毕业论文 精品论文 人胚胎干细胞体内分化途径获取神经干细胞及dna甲基化酶dnmt3a和dnmt3b表达下调对人胚胎干细胞的影响关键词：人胚胎干细胞 神经干细胞 dna甲基化酶 dnmt3a 体内分化途径摘要：人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5

2、）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法

3、传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc

4、标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个

5、新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b

6、表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。正文内容 人类胚胎干细胞（human embryon

7、ic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化

8、法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad

9、射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，

10、gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响

11、。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid

12、小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立

13、人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶

14、消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化

15、为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hesc

16、s-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测he

17、scs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常

18、分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞

19、生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法

20、，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glia

21、l fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methylt

22、ransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；

23、dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。

24、 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c

25、处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells

26、，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用

27、贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行a

28、kp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs

29、分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs

30、饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结

31、论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubul

32、in，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransf

33、erase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnm

34、t3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生

35、物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征

36、鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神

37、经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经

38、元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关

39、基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所

40、必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝

41、裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作

42、时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neur

43、on-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新

44、生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、s

45、ox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性

46、细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟

47、胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化

48、途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测npc分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到

49、npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；

50、rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测

51、dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse e

52、mbryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的ko-dmem培养基中，采用hescs的酶消化法传代和机械法（巴氏德管制作的传代工具）传代；并对培养的hsf6进行碱性磷酸酶染色、表面标记检测、体外拟胚体（embryoidbody，eb）分化能力检测等特征鉴定。 结果：第3-5代的mef经10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时或经3000rad射线照射后能抑制增殖。酶消化法传代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易残留和扩增；机械法传代的hescs克隆大小较均匀，分化克

53、隆残留较少或培养中容易被剔除，但机械法传代过程繁琐、操作时间较长、工作量大；培养的hsf6能维持未分化状态。 结论：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分离和培养方法，10g/ml丝裂霉素c处理1-3小时，或3000rad射线照射后可作为hsf6的饲养层；酶消化法和机械法均可用于hescs的传代。 第二章：hescs体内分化途径获取神经干细胞。 目的：从hescs畸胎瘤中分离人神经干细胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：将hescs注射到scid鼠体内分化为畸胎瘤，采用贴壁培养法从中分离人npc；免疫组织化学法检测npc标记-巢蛋白（nestin）；检测np

54、c分化能力，对分化细胞检测神经元标记-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和胶质细胞标记-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 结果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化为畸胎瘤，经过贴壁培养和连续传代从中分离到npc，免疫组织化学检测nestin呈阳性，能分化为神经元和神经胶质细胞，分别表达tuj和gfap。 结论：利用贴壁培养法可从hescs畸胎瘤中分离到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型为细胞组织工程、发育分化研究提供了一个新的方法。 第三章：dnmt3a和dn

55、mt3b表达下调对hescs的影响。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表达下调后对hescs的影响。 方法：观察dnmt3a与dnmt3b表达下调后hescs的生长特性；免疫荧光检测hescs表面标记；rt-pcr检测维持胚胎干细胞自我更新和维持未分化的相关基因；检测hescs体外eb分化情况，在不同分化时间行akp染色和rt-pcr检测三个胚层基因表达情况；检测hescs在scid鼠体内分化能力。 结果：dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs：在mef上呈克隆

56、式生长，表面标记检测呈hesc特征，表达oct3/4、sox2和nanog；eb分化障碍、akp消退延迟，dnmt3b下调后hescs分化时神经外胚层标记基因提前出现；dnmt3a和dnmt3b表达下调后hescs在scid小鼠体内未形成畸胎瘤。 结论：dnmt3a和dnmt3b表达下调后不影响hescs未分化状态的维持，推测dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化状态维持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表达下调导致hescs分化缺陷，推测dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hescs）来源于早期胚胎、具有自我更新和分化发育为三个胚层组织潜能的多能性细胞。hescs在多个领域，如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。 第一章：人胚胎干细胞株hsf6培养。 目的：探索和建立人胚胎干细胞株hsf6的培养方法。 方法：从icr胎鼠（e13.5）中分离胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，mef），检测丝裂霉素c处理或射线照射后mef的生长状态并作为hescs饲养层；将hescs培养于含10n