第三课DNA琼脂糖凝胶电泳

1、第四课DN A琼脂糖凝胶电泳实验原理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳迁移率（乂称泳动率）足带电荷颗粒金一定电场强度下，单位时间 内在介质中的迁移距离。迁移率与样品分了所带电荷密度、电压及 电流成正比，与样品的分子人小.介质粘度及电阻成反比。核酸是两性分子。DNA的等电点为44.5RNA的等电点为225。 许pH3.5时，DNA的碱基上的氨基解离，而三个磷酸集团只合第 一个解离，整个核酸分子帶正电荷。当pH在8.0以上时，碱肚几乎 不解离，磷酸集团全部解离，核酸分了带负电荷。不同大小和构彖 的核酸分子的电荷密度人致相同，在口住泳动时，迁移率签别很小。 琼脂糖足从海洋植物晾脂中提取而來并经糖

2、基化修饰的聚介链线性 分子。使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介丿贡，具有分了筛效应。电泳 时，分子人小和构彖不同的核酸分子在琼脂糖中的迁移率令较人差 异，可以被有效分离。琼脂糖凝胶电泳操作简巾“快速，是分戾.鉴定、纯化核酸分子的实验原理琼脂糖凝胶浓度和有效分离线性DNA分子 的长度之间的关系琼脂糖凝 胶浓度有效分离线性DNA分子 的长度（kb）0.45-600.70.8-101.00.牛61.50.2-41.750.2-32.00.1-3实验原理 渓化乙锭（E十hidium bromide. EB）是一种岳度灵敏的荧光染色剂，浪化 乙锭HJ3O2n m和366nm紫外光激发并放射出590nm橙红色信

3、廿。 观察琼脂糖凝胶屮DZA放常用的方法足利用澳化乙锭进行染色。混化乙锭 含何一个可以嵌入DNA堆积碱乩Z间的一个一环平而医团。它与DNA的结 介几乎没有碱基序列特异件。在简离子强度的饱和溶液中，大约每25个碱 基插入一个渓化乙锭分子。当染料分子插入后，兀平向基团与螺旋的轴线垂 亡并通过范徳华力与I:卜碱基相互作用。DZA吸收254nm处的紫外辐射并 传递给染料，而被结合的染料木身吸收3O2nm和366nm的激发光。 浪化乙锭DZA复合物的荧光产率比没冇结合DNA的染料高出20-30倍，半 凝胶中含有游离的浣化乙锭（05u9/ml）时，町以检测到少至lOng的NDA 条带。 滇化乙锭恢入DNA

4、碱基对Z间是，可使DNA的负超螺旋解旋，因此可降低 负超螺旋DMA的电泳迁移率。如电泳II的是比较不同大小的DNA的分子瓦 应在电泳完毕后川0.5ug/ml的渓化乙锭染色丫小时。 涣化乙锭町以恨入碱基分子中，导致错配。因此浜化乙锭是强诱变剂，具有 高致癌性! 涯化乙锭溶液的须净化处理后方可丢弁。实验器材及试剂1. 实验器材 电泳仪 电泳杷I 琼脂糖凝胶制胶板 梳齿2. 实验试剂琼脂糖lOObp, lkb梯度DNA分子量标准5OXTAE电泳缓冲液体（IX缓冲液浓度40 mMTrisHAc, pH 8.0, 1 mM EbTA ）6X样品缓冲液GoldView核酸指示剂（或澡化乙锭）DNA样品1.

5、2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.实验步骤在锥形飙中用1XTAE配制1%的晾脂糖凝胶（40ml）。 胃微波炉中加热至沸腾M史琼脂糖完全溶解。将锭形瓶取出，摇见混匀，再将琼脂糖讶微波炉小加热至沸腾。代室温冷却。准务制胶板，插好梳齿。当琼脂糖冷至709左右（手握烧瓶可以耐受）加2U1DNA染料 （GoldView）,混匀。将凝胶到入制胶板（注意，不耍产生气泡）。在室温静置30分钟。待凝胶完全凝固后，小心拔去梳齿。将凝胶放入电泳椚中。在电泳槽中加入1XTAE至液面漫过凝胶表而约l-2mnr 吸取5卩1质粒（或PCR产物）DNA+ lgl 6X电泳样品缓冲液混匀。将样品小心加入电

6、泳凝胶的样品孔屮。在样品旁边的孔中加入6pl DNA分子量标准品。质粒用lkbDNAmaiker, PCR 产物用 1 OObpDNAmar k er。正确连接电泳仪器电极，以8V/cm的恒运电压电泳25-30分钟。电泳结束后，关闭电泳仪。将凝胶取出。胃紫外灯箱上适当波K的紫外灯下观察质粒DNA的电泳帖况。注意事项灌一般凝胶碍冷却30 min以上方町拔梳齿，应急的悄况卜可以将成羽的凝胶块放 4C冰箱屮冷却15 min左右。加样器吸头应恰好代丁凝胶点样孔中，不町刺穿礙胶，也耍防1匕将样品溢出孔夕卜。 正确连接电泳仪的电极。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同。电泳缓冲液刚好没过凝胶1-2

7、nun为好，电泳缓冲波太多则电流加大，凝胶发热。 电泳时凝胶上所加迫压般不超过10v/cm（指的是正负电极之间的距离而不是 凝胶的长度）。若电压过筒分辨率会降低。电泳椚中缓冲液使用次数过女，缓冲能力卜降。特别是TAE缓冲液，一般用23 次就要更换，TBE缓冲液则可仗用10次左右。使用漠化乙锭对DNA样品进行染色，町以在凝胶中加入终浓度为05|J g/ml的EB。 EB掺入DNA分子屮。混化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配対碱宰Z 间。可以在电泳过程屮随时观察核酸的迁移情况，但是如果耍测定核酸分了人小 时.不宜使用以上方法，而是应该在电泳结束后，把凝胶浸泡在含05pg/inlEB 的溶液中103