单细胞多重巢式PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究(一)

1、单细胞多重巢式 PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究 （一） 作者：朱琴徐炳森黄学锋周颖 【摘要】目的建立单细胞的多重巢式荧光 PCR技术，为开展常染色体 显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断提供依据。方法用四重荧光 巢式 PCR和毛细管电泳对单个淋巴细胞的 KG8、SM6、CW4和 CW2 四 个微卫星位点进行多态性分析。结果单个淋巴细胞KG8、 SM6、 CW4和 CW2 扩增成功率分别为 85.93（ 55/64 ）、 89.06%（ 57/64 ）、 92.18%（59/64）和 89.06%（ 57/64），KG8、CW4和 CW2的等位基因脱扣 率分别为 25.64%（10/

2、39）、25（ 4/16）和 7.01%（4/57），两个位点 同时发生的 ADO 率为 2.56%（1/39）。结论该方法为常染色体显性多囊 肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断提供了依据。 【关键词】微卫星多囊肾胚胎植入前遗传学诊断 【 Abstract 】 ObjectiveToestablishthetechnologyofmultiplenestfluorescencesinglecellPC R,forpreimplantationgeneticdiagnosisforautosomaldominantpolycystickidn eydisease.MethodUsequadruplex

3、nestedfluorescentPCRandcapillaryelectro phoresistoanalysisthepolymorphismtypeofKG8,SM6,CW4andCW2ofsinglel ymphocytes.ResultTheamplificationsuccessrateofKG8,SM6,CW4andCW2ar e85.93%,89.06%,92.18%and89.06%,respectively,andtheADOofKG8,CW4an dCW2are25.64%,25%and7.01%,WhiletheADOis2.56%intwomicrosatellite

4、sd iscoveredsimultaneous.ConclusionItprovideanevidenceofusingthistechniqueforthePGDforADPKD.【Keywords】MicrosatelliteADPKDPreimplantationgeneticdiagnosis常染色 体显性多囊肾疾病( autosomaldominantpolycystickidneydisease,ADPKD) 是最常见的常染色体显性遗传的单基因遗传病，人群发病率为 1/1000 1。ADPKD的主要表现为肾脏进行性囊性改变， 常导致终末期肾病， 居我国终末期肾病病因的第 4 位

5、2。除了肾脏病变外，还累及全身 多个器官，如肝囊肿、高血压、颅内动脉瘤、心瓣膜畸形等，是一全 身性疾病。而且 ADPKD具有延迟性发病的特点，其症状发生前检查结 果很少能影响未生育患者的生育意向，使其成为最易遗传给下一代的 严重遗传病之一。 因此，对 ADPKD患者进行 PGD既可满足患者生育的 愿望，又可避免生育患有 ADPKD的后代。目前认为，ADPKD主要与 PKD1 和 PKD2基因有关， PKD1突变引起的 ADPKD占 80%85 3，4， PKD2基因突变引起的 ADPKD占 10%15% 5，这两个基因结构复杂， 缺乏突变热点，因此难以通过直接检测突变行 PGD诊断。本研究拟利

6、 用与 PKD1紧密连锁的 KG8、SM6、CW4 和 CW2 四个微卫星位点，行 四重巢式荧光 PCR和毛细管电泳，为 ADPKD的 PGD研究提供诊断依据。 1 材料与方法1.1 实验材料任取 2位来本中心就诊患者的淋巴细胞 64 个，其中 A 患 者获取 18 个，B患者 46 个。取材均得到患者的同意。1.2 实验方法( 1)单个淋巴细胞制备：先用 percoll60 分离出单个核细 胞，然后在倒置显微镜下通过显微操作吸取单个淋巴细胞，分别在 3滴 PBS 液中洗涤，同时取最后 1 个微滴洗涤后液体为阴性对照，将单 个淋巴细胞转移于含 5l细胞裂解液的 PCR管中， 20保存备用。(2

7、) PCR反应： KG8、CW4和 CW2的内引物参考文献 6，其余引物均由 primer3 软件自动生成。 内引物中正引物均有 FAM荧光标记。引物由上 海生工生物工程技术服务有限公司合成， 具体内外引物序列见表 1。第 一轮 PCR：64 个淋巴细胞均应用四重巢式 PCR，同时扩增微卫星 KG8、 SM6、CW4、CW2，反应体系均为 50，l其中模板含 5l细胞裂解液的 单个卵裂球， 10PCRbuffer4.5，dlNTP3l(10mmol/L)，镁离子 4.5 l (50mmol/L )，KG8和 CW2 正反引物各加 2(l10mol/L)，SM6和 CW4 引物各加 3(l10u

8、mol/L)，HighFidelityTaq酶 0.3 ，l用水补充至 50。l 先灭活蛋白酶 K，45 1min，9620min，然后在 72时将上述反应液 加入到模板里， 961min，96 30s，58 1.5min，721min，共 25 个循环，最后 72再延伸 10min。 10PCRbuffe、r dNTP、镁离子和酶均 由 invitrogen 公司。第二轮 PCR：反应体系均为 10，l KG8 反应体系为 10 PCRbuffer1，10lmM 的 dNTP0.5 ，l5mM 镁离子 1.4 ，l10M 的 KG8 正反引物各 0.4 ，l模板 1，lHighFidelit

9、yTaq酶 0.07 ，l最后用水补充 至 10；lPCR循环条件 964min,9645s,5845s，7230s，共 36 个 循环 ,最后 72再延伸 10min。SM6、CW4、CW2、镁离子浓度依次为 0.9mmol/L 、1.1mmol/L 、0.9mmol/L ，退火温度依次为 60、60、55， 其余条件都等同于 KG8。(3)电泳：扩增产物经 1.5%的琼脂糖凝胶电 泳，出现预期条带的样品继续扩增45l进行毛细管电泳，做 STRshorttandemrepeats，STR）分型（由上海基康公司和上海联合基因提 供服务）。表 1 四个微卫星位点的内外引物序列2 结果2.1CW4

10、、CW2、KG8微卫星位点信息 A 患者 CW4和 CW2 位点有多态 性信息， B 患者 KG8和 CW2位点有多态性信息。2.2 单个淋巴细胞扩增成功率 64 个淋巴细胞有 59 个扩增成功， 扩增成 功率为 92.18%，其中 KG8扩增成功率为 85.93（55/64），SM6 扩增 成功率为 89.06%（ 57/64）， CW4 扩增成功率为 92.18%（59/64）， CW2 扩增成功率为 89.06%（57/64 ）。2.3 等位基因脱扣率 KG8 的等位基因脱扣率为 25.64%（10/39），CW4 的等位基因脱扣率为 25（ 4/16），CW2 的等位基因脱扣率为 7.01% （4/57），在 B 患者中有 1 个淋巴细胞的两个位点同时发生 ADO，发生 率为 2.56%（ 1/39）。2.4 阴性对照阴性对照未发现阳性结果