总黄曲霉毒素ELISA定量检测试剂盒研制(一)

1、总黄曲霉毒素 ELISA定量检测试剂盒研制 (一)【摘要】目的研究并建立敏感、特异和快速的针对食品中总黄曲霉毒 素的 ELISA检测方法，形成具有我国自主知识产权的快速定量检测试剂 盒。方法在生产抗总黄曲霉毒素单克隆抗体基础上， 利用间接竞争 ELISA 方法，研制出食品中总黄曲霉毒素快速检测试剂盒，并对试剂盒的各 项技术参数进行测定。结果该试剂盒对黄曲霉毒素 B+G 标准品的最低 检出浓度为 ml，标准曲线的线性范围为 ml，线性方程 y=-；对黄曲霉毒素 B+G50的抑制浓度为ml ；试剂盒的条内变异系数为，条间变异系数为 ，抗体亲和力常数为-10molL；对玉米3 个加标水平的平均回收率

2、分别为 ， 和 ； 对花生的 3 个加标水平的平均回收率分别为 ， 和 。试剂盒 37可放置 96h 以上；试剂盒对黄曲霉毒素 B1、B2、 G1、G2 的交叉反应率分别为 100，104和 19，与其他真菌毒素无交叉反应。结论研制出的 ELIS试剂盒能定量检测食品中总 黄曲霉毒素。【关键词】总黄曲霉毒素黄 曲 霉 毒 素 (Aflatoxin) 是 黄 曲 霉 ( XspeEillusflavus)和 寄 生 曲 霉 等产生的一组结构类似的次生代谢产物。 据 Gabal等1 报道，有 40的黄曲霉菌株培养物可同时测出黄曲霉毒素 B1，B2，G1， G2( AFB1、 AFB2、 AFG1、A

3、FG2)。同时黄曲霉毒素的毒性具有协同作 用，因此，90以上的国家都制定了食品中总黄曲霉毒素的限量标准。 目前总黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层层析法、色谱法。我国执行 的食品中总黄曲霉毒素 B1+B2+G+G2 的国家标准测定方法是薄层色 谱法和微柱筛选法， 均为目测半定量法， 最低检出浓度为 5g/kg 2。 这些方法因受本身的限制，精确度低、敏感性差；样品前处理过程复 杂费时；或需要价格昂贵的仪器，检测成本高，难以推广应用，影响 了粮油食品中黄曲霉毒素的有效监测。 酶联免疫吸附法 （ELISA是） 在免疫 学和细胞工程学基础上发展的一种微量检测技术，特别适合于对黄曲 霉毒素污染监控中大量样

4、本的筛检。本研究以 B 细胞杂交瘤技术以能 分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株为基础，建立了检测 玉米、花生中总黄曲霉毒素的 ELISA检测方法， 并初步研制出具有我国 自主知识产权的 ELISA试剂盒。1 材料与方法材料主要仪器 CO2培养箱（美国 Queue公司）；洁净工作台 （北京半 导体设备一厂 ）；生物倒置显微镜 （日本欧林巴斯光学株式会社 ）；酶标 分析仪 （瑞士 SUNRIS公司）；电子分析天平 （瑞士 Mettler 公司）；低温高 速离心机 （德国 Hermle公司）；电泳仪 （美国 BIO-RAD公司）等。试剂 AFB1-BSA、黄曲霍毒素 （B+G）（Aflato

5、xinB+G、） 黄曲霉毒素 B1（AflatoxinB1，AFB1）黄曲霉毒素 B2（AflatoxinB2，AFB2）、黄曲霉毒素 G1（AflatoxinG1，AFG1）、黄曲霉毒素 G2（AflatoxinG2，AFG2）、T-2 毒素 (T-2toxin)、赭曲霉毒素 A(OchratoxinA)、展青霉素 (Patulin)、脱氧雪腐镰 刀菌烯醇 (Deoxynivslenol， DON)、玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEN)、 匙孔嘁血蓝素 (KLH)、牛血清白蛋白 (BSA)、伏马菌素 B1、抗体亚类测定 试剂盒 (IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2

6、a，IgG2b，IgG3)(美国 Sigma 公司)； RPMI1640 培养基、选择性培养基、福氏佐剂 (完全、不完全 )、 二甲基亚砜 (DMSO)、吐温 20(Tween20)、聚乙二醇 (PEG，MW5000)、青 霉素，链霉素 (美围 Gibco 公司)；辣根过氧化物酶羊抗鼠 IgG(北京中山 试剂公司 )； 30H2O2(优级纯，北京化工厂 )。溶液系统 ELISA使用液参考文献 3制备。 细胞系与实验动物小鼠骨髓瘤细胞系 Sp20 由本室传代，并 经 8 一氮杂鸟嘌呤处理。雌性 BALB c 小鼠，体重 1820g(军事医学 科学院实验动物研究所动物繁育场 )。抗总黄曲霉毒素杂交

7、瘤细胞株本研究室自制。方法单克隆抗体生产将抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞注入 BALB/c 小 鼠腹腔，获得含抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的腹水，并将所得腹水采 用饱和硫酸铵盐析法进行纯化 4。抗体特性鉴定抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚 类鉴定试剂盒；抗体的纯度及分子量用十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝 胶电泳 (SDS-PAGE测)定；IgG含量采用二喹呆甲酸 (BCA)蛋白测定试剂 盒进行测定；抗体滴度测定采用间接非竞争 ELISA方法：以 AFB1-BSA 为包被抗原，从 1：10000 倍开始将抗体进行倍比稀释，以 Sp20 细 胞培养上清为阴性对照，以 （A 试验-A 空白）（A 对照

8、-A 空白） 的最大稀释倍数为滴定终点；抗体的特异性和抗体的灵敏度用间接竞 争抑制性 ELISA法进行测定， 参试毒素为黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （DON）、赭曲霉素 A（OA）、伏马菌素 B1、T-2 毒素 和载体蛋白 BSA。试剂盒各项技术参数研究方法的检出限 （灵敏度 ）用间接非竞争 ELISA法作抗体滴度测定， 找出合适的抗体工作浓度。 再用间接竞争 ELISA法作棋盘滴定， 找出合 适的包被浓度与毒素的竞争浓度，最后作标准曲线，确定线性范围及 检出限。方法的回收率试验根据试剂盒的检测范围确定加标浓度， 在不 含黄曲霉毒素的玉米和花生样品中分别进行高、低 2 个浓度的加标回 收试验，每个加标水平做 5 个重复的平行样。样品的提取方法为：样 品粉碎后使其 90通过 250500m网筛。称取 5g加到 100ml 具塞三 角烧瓶中，加入及 25ml 甲醇水溶液 （70：30，vv），剧烈震荡 30min 后过滤。滤液用纯水稀释 10 倍进行检测。样品中黄曲霉毒 素浓度 （ gKg）=CDX W。式中： C-酶标板上测的黄曲霉毒素浓度 （ng ml），根据标准曲线求得； D-样品提取液的体积 （ml）；X-稀释倍数； W-样品重量 （g）。试剂