游离氨基酸总量的测定

1、植物体内游离氨基酸总量的测定方法一：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应， 产生蓝紫色化合物， 其颜色的深浅 与游离氨基酸的含量成正比。二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 个；漏斗（直径 6 厘米） 3 个、滤纸适量；20ml刻度试管7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；试管 架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封试管口） ；吸 水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅（含铁丝筐） 。三、试剂1. 3% 茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试 剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约 10 天。

2、2. 氰酸盐缓冲液（按以下方法配制） ：(1) NaCN备液 0.01mol/L (490mg/L)。（2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸 馏水中，加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至 1L。取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。3. 标准氨基酸精确称取在80C下烘干的亮氨酸13.1mg （或a -丙氨酸8.9mg）溶于10%勺 异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L 的标准氨基酸贮备液， 置冰箱中保存。 为了制备工作液， 可取贮备液与等量 无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即1ml

3、含氨基酸0.5卩mol，或氨 基氮7卩g。4. 95% 乙醇；异丙醇（分析纯）四、操作步骤1. 标准曲线的制作取20ml刻度试管18支，按下表1加入各试剂。加完试剂后混匀，在100C水浴中加热12min （加热时封口），取出在冷水中迅 速冷却，立即于每管中加入 5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时 形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于 570nm 波长下测其光密度（以空白管为参比） ，以氨基酸浓度为横坐标，光密度为 纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片 （或其它组织），洗净擦干， 剪碎 混匀，迅速称取0.100.20g

4、（视氨基酸含量多少而定），共称3份，分别加 入20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜），置沸水浴 中 20min 以提取游离氨基酸， 到时取出在自来水中冷却， 把上清液滤入 25ml 容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min,过滤 并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，摇匀。3. 样品测定 另取 4支洁净干燥的试管，其中 3支分别加入 0.5ml 提取液,另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别加入NaCh缓冲液、 水合茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min，冷却后，再分别加5ml 95汇醇，摇匀，以空白作参比，在波长57

5、0nm下测其光密度。根据光密度查标准曲线 （或用回归方程计算） 即可求出提取液中氨基酸的浓 度。方法二：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应， 产生蓝紫色化合物， 其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶 25ml 或 50ml 3 个；漏斗（直径 6 厘米） 3 个、滤纸适量；20ml刻度试管7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；试管架； 玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封试管口）；吸水纸；擦 镜纸适量；电炉；水浴锅（含铁丝筐）。三、试剂1. 3%茚三酮试剂称3g茚三酮用95聽醇溶解定容到100ml容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试

6、 剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约 10天。2. 氰酸盐缓冲液 （按以下方法配制）：（1）NaCN贮备液 0.01mol/L （ 490mg/L）。（ 2）醋酸缓冲液：称 360g 醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约 300ml 无氨蒸 馏水中，加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至 1L。取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。3. 标准氨基酸精确称取在80C下烘干的亮氨酸13.1mg（或a -丙氨酸8.9mg）溶于10%勺 异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为 1mmol/L 的标准氨基酸贮备液， 置冰箱中保存。 为了制备工作液， 可取贮备液与等

7、量无氨 蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即卩1ml含氨基酸0.5卩mol，或氨基氮7卩g。4. 95%乙醇；异丙醇（分析纯）。四、操作步骤1.标准曲线的制作取20ml刻度试管18支，按下表1加入各试剂。力卩完试剂后混匀，在100C水浴中加热12min （加热时封口），取出在冷水中迅速冷 却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红 色产物被空气中的氧所氧化而褪色， 此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光 密度（以空白管为参比），以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准 曲线，求出直线方程。表1各试管加入试剂量莒号M21$请斬醴氯卑肿-Tr0

8、10203C.40.3QhI0.40_1血*OuJIB肪祖师碍钱灣報ml0303010.50.3艸巨湫mbOl?2030!0J0.504M5232样品提取选取有代表性的植物叶片（或其它组织），洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取0.100.20g （视氨基酸含量多少而定），共称 3份，分别加入2 Oml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜），置沸水浴中20min以提取游离氨基酸，至叩寸取出在自来水中冷却，把上清液滤入25ml容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min,过滤并反复冲洗残渣， 最后定容至刻度，摇匀。3. 样品测定另取4支洁净干燥的试管，其中3支分别加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚 三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热 12min，冷却后，再分别加5m l 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长 570nm下测其光密度。根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度。4.计算游离氨基酸含量CxTk14（xh-哪