基因工程final课件

1、基因工程final1 第二章第二章 基因工程基因工程 基因工程final2 参考书参考书: : 1. 基因工程基因工程孙明孙明 高等教育出版社高等教育出版社 2. 基因工程原理基因工程原理 吴乃虎吴乃虎 科学出版社科学出版社 3. 分子克隆实验指南分子克隆实验指南 J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis. 金冬雁等译，科学金冬雁等译，科学 出版社出版社 4. 英国英国 Principles of Gene Manipulation 5.基因操作原理基因操作原理 中文版中文版 瞿礼嘉、顾红瞿礼嘉、顾红 雅雅 译译 高等教育出版社高等教育出版社 基因工程final3 利

2、用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种 生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用 人工合成的方法获取基因，然后经过一系 列切割，加工修饰，经连接反应形成重组 DNA分子，再将其转入适当的受体细胞 （转化），以期获得基因表达的过程。 基因工程final4 n遗传工程遗传工程(genetic engineering); n基因克隆基因克隆(gene cloning); n分子克隆分子克隆(molecular cloning); n基因操作基因操作(gene manipulation); n重组重组DNA技术技术(recombination DNA technique) n克隆克隆(clone): 作名

3、词时指含有某目的作名词时指含有某目的DNA片段的片段的 重组重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。分子或含有该重组分子的无性繁殖系。 n作动词时是指基因的分离与重组过程。作动词时是指基因的分离与重组过程。 基因工程final5 血液血液 供血者供血者 受血者受血者 注射器注射器 目的基因目的基因 供体供体 受体受体 载体载体 基因工程final6 将供体或在细胞外产生的将供体或在细胞外产生的 核酸（物质）分子核酸（物质）分子 插入到病毒插入到病毒(virus)、质粒、质粒(plasmid)或或 其它载体系统其它载体系统(vecter system)中中 从而形成一种新的可连续繁殖的有机体

4、从而形成一种新的可连续繁殖的有机体 再整合到那些本来不含该类物质的宿主再整合到那些本来不含该类物质的宿主(host) 受体中受体中 基因工程final7 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 2020世纪世纪7070年代，年代，Paul Paul BergBerg及其同事第一个创及其同事第一个创 造重组造重组DNADNA分子分子 Paul BergPaul Berg 基因工程final8 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 19731973年年, ,美国美国 Herber Herber BoyerBoyer教授和教授和StanleyStanley CohenCohen教授在人类历教授

5、在人类历 史上第一次进行了有史上第一次进行了有 目的的基因重组尝试，目的的基因重组尝试， 并据此提出了并据此提出了“基因基因 克隆克隆”的策略。的策略。 Herbert W. Boyer, Ph.D. 基因工程final9 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 19751975，发现，发现分子克隆工具酶分子克隆工具酶 利用限制性内切利用限制性内切 酶（酶（RestrictionRestriction endonucleaseendonuclease）切）切 割产生特殊割产生特殊DNADNA 片段的能力使得片段的能力使得 纯化那些纯化那些DNADNA片片 段成为可能段成为可能 基因工程fin

6、al10 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 19781978年，重组胰岛素年，重组胰岛素 基因工程final11 19791979年，人类生长激素年，人类生长激素 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 基因工程final12 First transgenic animal, the golden carp, is cloned by Chinese scientists in 1981. Canadas first biotechnology company, Allelix, is formed in 1995. nToday Biotechnology has made a g

7、reat impact in agriculture ,medicine ,food and many other products. 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 基因工程final13 编码蛋白质或RNA等具有特定功能 产物的遗传信息的基本单位，是染 色体或基因组的一段DNA序列。 包括编码序列(外显子)、编码区前 后对于基因表达具有调控功能的序 列和单个编码序列间的间隔序列 (内含子)。 基因工程final14 n DNA exon1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4 转录 Pro-mRNA exon1 intro

8、n 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4 mRNA 剪接 翻译 蛋白质 真核生物中蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系真核生物中蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系 基因工程final15 用进废退，获得性遗传用进废退，获得性遗传 达尔文进化论达尔文进化论 拉马克进化论拉马克进化论 过度繁殖，生存斗争过度繁殖，生存斗争 遗传和变异，适者生存遗传和变异，适者生存 基因工程final16 基因工程的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可 以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、以使原核生物与真核生物

9、之间、动物与植物之间、 人与其他生物之间的遗传信息相互重组和转移。人与其他生物之间的遗传信息相互重组和转移。 为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上？ 这种嫁接时如何实现的？ 基因工程final17 基因具有相同的物质基础 基因是可切割的 基因是可转移的 多肽与基因之间有对应关系 遗传密码通用 基因可以复制遗传 基因工程研究的理论依据 3 3 起始密码子起始密码子 5 5 腺嘌呤（腺嘌呤（A A）胸腺嘧啶（）胸腺嘧啶（T T） 胞嘧啶（胞嘧啶（C C）鸟嘌呤（）鸟嘌呤（G G） 基因工程final18 （1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新 的重组DNA分子； （3）用重组

10、DNA分子转化受体 细胞，并能在受体细胞中复制和 遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或 生物体通过培养，获得所需的遗 传性状或表达出所需要的产物。 重组重组DNA操作一般步骤操作一般步骤 生物材料生物材料 mRNADNA RNA cDNA 文库文库基因组文库基因组文库人工合成人工合成 目的基因目的基因克隆载体克隆载体 受体细胞受体细胞重组重组DNA 克隆子克隆子 转基因生物转基因生物 基因工程final19 基因工程操作的工具 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 n将目的基因片断从受体细胞内提取，将目的基因片断从受体细胞内提取， 需要基因的剪刀需要基因的剪刀限制性核酸

11、内切酶。限制性核酸内切酶。 n将目的基因与质粒将目的基因与质粒DNADNA连接，连接， 需要基因的针线需要基因的针线DNADNA连接酶。连接酶。 n将目的基因运入大肠杆菌，将目的基因运入大肠杆菌， 需要基因的运输工具需要基因的运输工具运载体。运载体。 基因工程final20 基因工程final21 限制性核酸内切酶 n限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease） 定义定义 n是一类能识别双链是一类能识别双链DNADNA中特殊的核苷酸序列，并使每条中特殊的核苷酸序列，并使每条 链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核

12、糖核酸酶。链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 类型类型 n型限制酶 n型限制酶型限制酶 nIII型限制酶 不同限制酶能专一地识别不同限制酶能专一地识别 不同的特异核苷酸序列不同的特异核苷酸序列 基因工程final22 第第一一个个字字母母取取自自产产生生该该酶酶的的细细菌菌属属名名，用用大大写写； 第第二二、第第三三个个字字母母是是该该细细菌菌的的种种名名，用用小小写写； 第第四四个个字字母母代代表表株株； 用用罗罗马马数数字字表表示示发发现现的的先先后后次次序序。 Hind 属属系系株株序序属属系系株株序序 Haemophilus influenzae d株株 流流感感嗜嗜血血杆杆菌

13、菌d株株的的第第三三种种酶酶 限制性内切酶的命名 基因工程final23 型限制酶的特性 识别序列识别序列 6个：个：如：如：Not 5-GCGGCCGC-3（8个）个） 6个（大多数）：个（大多数）：如：如：EcoR 5-GAATTC-3 有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。 如：如：Sau3A识别识别 ： GATC BamH识别识别 ： GGATCC 有的限制酶识别多种核苷酸序列。有的限制酶识别多种核苷酸序列。 如：如：Hind识别识别 4种核苷酸序列：种核苷酸序列： 5-CTPyPuAC-3 （Py嘧啶碱基嘧啶碱基C或或T；Pu 嘌呤碱基嘌呤碱

14、基A或或G ） 基因工程final24 5 35 3 限制酶：限制酶：BamH 结构相同，方向相反的重复序列，正读与反读都相同。结构相同，方向相反的重复序列，正读与反读都相同。 旋转对称或左右互补对称结构。旋转对称或左右互补对称结构。 为便于书写，识别序列可以以为便于书写，识别序列可以以5 3走向的单链走向的单链DNA表示。表示。 型限制酶的特性 II型限制酶的识别序列一般都具有回文结构型限制酶的识别序列一般都具有回文结构 (palindrome)(palindrome) 5 35 3 基因工程final25 (a)5P单链延伸的粘性末端单链延伸的粘性末端 (b)3OH单链延伸的粘性末端单链延

15、伸的粘性末端 粘性末端（粘端）粘性末端（粘端） G AATTC CTTAA G GAATTC CTTAAG 如：如：Eco R 5 3 5 3 5 35 3 CTGCA G G ACGTC CTGCAG GACGTC 如：如：Pst 5 3 5 35 3 5 3 各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形 成各种粘性末端或平整末端； 型限制酶的切割类型 基因工程final26 平头末端（平端）平头末端（平端） CCC GGG GGG CCC CCCGGG GGGCCC 如：如：Smal 5 3 5 35 3 5 3 各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形 成各种粘性末端或平整末端； 型限制

16、酶的切割类型 基因工程final27 被同一种限制酶切断的几个DNADNA 是否具有相同的黏性末端？ 用同种限制酶切割用同种限制酶切割 基因工程final28 同尾酶（同尾酶（isocaudamer） 有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶子有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶子 序列也各不相同，但切割序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性后，产生相同的粘性 末端，这一类限制酶特称为末端，这一类限制酶特称为同尾酶同尾酶。这两个相同的。这两个相同的 粘性末端称为粘性末端称为配伍未端配伍未端。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G A T

17、CTAG GATCT A 同尾酶和同裂酶同尾酶和同裂酶 基因工程final29 同裂酶（同裂酶（isoschizomer） 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶 序列，这类酶特称为序列，这类酶特称为同裂酶同裂酶。同裂酶的切点位置可。同裂酶的切点位置可 相同或不同。相同或不同。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bst （a）切点位置相同）切点位置相同 基因工程final30 CCCGGG GGGCCC C GGGCC CCGGG C Xma CC

18、CGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC Sma （b）切点位置不相同）切点位置不相同 同裂酶（同裂酶（isoschizomer） 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶 序列，这类酶特称为序列，这类酶特称为同裂酶同裂酶。同裂酶的切点位置可。同裂酶的切点位置可 相同或不同。相同或不同。 基因工程final31 单酶切法单酶切法 双酶切法双酶切法 部分酶切部分酶切 DNA分子片段化 天然DNA或化学合成的 DNA常需酶切成可连接 重组的DNA片段，即 DNA分子的片段化。 HinHind d IIIIIISalSal I I 基因工

19、程final32 具有互补粘性末端片段的连接具有互补粘性末端片段的连接 2 2、具平末端、具平末端DNADNA片段之间的连接片段之间的连接 3 3、DNADNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接 4 4、DNADNA片段加杆后连接片段加杆后连接 DNADNA片段连接 基因工程final33 DNA连接酶 E. coli DNA 连接酶连接酶 只能催化互补粘性只能催化互补粘性 末端之间的连接末端之间的连接 DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在 一起的3-OH 末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使 末端连接。 T4 DNA 连接酶连接酶 催化互补粘性末端和催

20、化互补粘性末端和 平末端之间的连接，平末端之间的连接， 但平末端之间连接的但平末端之间连接的 效率比较低效率比较低 。 基因工程final34 具有互补粘性末端片段的连接具有互补粘性末端片段的连接 E. coli DNA 连接酶连接酶 基因工程final35 具有互补粘性末端和平末端片段的连接具有互补粘性末端和平末端片段的连接 EcoRIEcoRI T4 DNA 连接酶连接酶 基因工程final36 末端转移酶 + 核酸外切酶 + DNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接 核酸外切酶核酸外切酶（exonuclease）： 在核酸水解酶中，是具有从分 子链的末端顺次水解磷酸二酯 键而生

21、成单核苷酸作用的酶的 修饰作用 基因工程final37 CTAG AAGC 共同的限制性内切酶酶切位点共同的限制性内切酶酶切位点 DNADNA连接酶连接酶 DNA片段末端加杆后连接片段末端加杆后连接 外切酶修饰外切酶修饰 酶切酶切 基因工程final38 运载体-基因克隆载体 基因工程final39 基因工程final40 大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体 可以克隆可以克隆 10kb以下以下 的片段的片段 基因工程final41 细菌人工染色体细菌人工染色体 克隆载体克隆载体 一般在一般在10kb10kb以下，以下， 能承载能承载40kb40kb左右左右 的外源片段。的外源片段。 基因工程fi

22、nal42 其他种类的载体包括：PCR克隆载体、噬菌体 克隆载体、细菌克隆载体、病毒克隆载体、穿 梭克隆载体、细菌人工染色体、细菌表达载体、 真核表达载体、昆虫细胞载体、酵母表达载体、 体外表达载体、荧光蛋白载体、双杂交载体、 信号转导载体、siRNA表达载体、热休克载体、 报告基因载体、亚细胞定位载体、转座子构建 载体、噬菌体展示载体 载体种类载体种类 基因工程final43 基因操作的基本步骤 基因工程final44 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来 提取目的基因的方法提取目的基因的方法 基因工程final45 细胞内总DNA的 提取分离程序 基

23、因工程final46 双链DNA加热至90-95变性解旋成为 单链DNA，成为互补链聚合反应的模版 降温至37-60 与模版复性结合 升温至70-75 ，DNA聚合酶催化引物 按5-3延伸，合成模版DNA链的互 补链 N个循环，达到个循环，达到2n的拷贝数的拷贝数 2 2、利用、利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因 PCR原理原理 基因工程final47 2 2、利用、利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因 引物引物1 目的基因目的基因 已知序列已知序列 已知序列已知序列 引物引物2 PCR扩增扩增 含有目的基因的含有目的基因的DNA片段片段 1、 必须知道待扩增目的基因必须知道待扩增目

24、的基因DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列 2、待扩增片段两端长约、待扩增片段两端长约20bp的序列已知，的序列已知， 3、允许扩增的、允许扩增的DNA片段长度一般在片段长度一般在1kb以内以内 4、 扩增未知序列或长达几千扩增未知序列或长达几千bp的大基因，需要特殊类型的的大基因，需要特殊类型的PCR策略策略 5、RT-PCR 、免疫、免疫PCR 、巢式、巢式PCR 、实时荧光、实时荧光PCR、原位、原位PCR技术等技术等30几种几种 基因工程final48 PCR之歌 从前你要扩增DNA， 总有培养大批细胞的重任要你背。 这时有个家伙叫Kary Mullis博士的， 他钻出来说体外合成也

25、OK！ 只消把你的模板混上缓冲液， 再加些引物 核苷和聚合酶。 变性，退火，和延伸。 加热凉凉加热好神奇！ 当你想要检测突变，来啊，做PCR吧！ 当你想要基因重组，来啊，做PCR吧！ 当你想要侦破大案，来啊，做PCR吧！ 当你想知道孩子他爹到底是哪个混蛋，来啊，做PCR吧！ Bio-rad 推出的 Scientists for better PCR 基因工程final49 3 3、人工基因合成法、人工基因合成法 基因工程final50 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 * * * * * * * * * * * * * * * * * * 磷酸化磷酸化磷酸化磷酸化磷酸化磷酸化 退

26、火退火连接连接退火退火连接连接退火退火连接连接 粘性末端粘性末端 粘性末端粘性末端 合成的全基因合成的全基因DNA 目的基因化学合成全片段酶促法连接示意图目的基因化学合成全片段酶促法连接示意图 基因工程final51 目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合-形成重组形成重组DNADNA 用限制酶切割目的基因和 用相同的限制酶切割质粒 使之出现一个切口，将目 的基因插入切口处，让目 的基因的黏性末端与切口 上的黏性末端互补配对后， 在DNA连接酶的作用下连 接形成重组DNA分子 基因工程final52 n基因工程中常用的受体细胞有 大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。如用质粒作 运载体

27、,则选大肠杆菌为受体细 胞 n目的基因可以随着受体细胞进 行快速的繁殖，在很短的时间 内获得大量的基因。 将重组将重组DNADNA导入受体细胞并扩增导入受体细胞并扩增 基因工程final53 将重组将重组DNADNA导入受体细胞并扩增导入受体细胞并扩增 转化转化：外源裸露DNA进入受体细胞，并在受 体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。 转染转染：如果外源DNA分子是病毒或者噬菌体 DNA或RT-DNA，那么把此过程也称为转染。 化合物诱导转化化合物诱导转化：感受态细胞 电穿孔转化电穿孔转化：高电压脉冲产生瞬间通道 超声波处理转化超声波处理转化：击穿细胞膜形成膜通道 脂质体介导转化脂质体介导转化：磷质双层包裹DNA 磷酸钙转染法磷酸钙转染法：动物细胞捕获DNA-磷酸钙沉淀物 常用转化法常用转化法 基因工程final54 筛选