发酵工程原理与技术课件

1、发酵工程原理与技术1 第二章第二章 发酵工业微生物菌种发酵工业微生物菌种 制备原理和技术制备原理和技术 发酵工程原理与技术2 第一节第一节 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育 p微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求 p发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育 p发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏 发酵工程原理与技术3 有些微生物能在厌氧的条件下生长有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长的生长 有些微生物能进

2、行复杂的代谢有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长有些微生物能在极端的环境下生长 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求 p微生物的特性微生物的特性 发酵工程原理与技术4 利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强可操作性要强 遗传性能要相对稳定不易变异和退化，不产生任何有遗传性能要相对稳定不易变异和退化，不产生任何有 害的生物

3、活性物质和毒素害的生物活性物质和毒素 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）菌无关） p工业化菌种的要求工业化菌种的要求 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工程原理与技术5 培养条件易于控制培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短生长迅速，发酵周期短 发酵过程产生的泡沫少发酵过程产生的泡沫少 不易感染它种微生物或噬菌体不易感染它种微生物或噬菌体 对需要添加的前体物质有耐受力，并不能将前体物质作为一对需要添加的前体物质有耐受力，并不能将前体物质作为一 般的碳源用。般的碳源用。 p工业化菌种的要求

4、工业化菌种的要求 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工程原理与技术6 工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物 p细菌（细菌（bacteriabacteria）：常用的有枯草芽孢杆）：常用的有枯草芽孢杆 菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。 p酵母菌（酵母菌（yeastyeast）：属单细胞真核生物，）：属单细胞真核生物， 主要分布于含糖较多的酸性环境中。常主要分布于含糖较多的酸性环境中。常 用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母 等。等。 发酵工程原理与技术7 工业生产常用的微生物工业生产常用的微生

5、物 p霉菌（霉菌（mouldmould）：喜偏酸性环境。可用于生产）：喜偏酸性环境。可用于生产 多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。 p放线菌（放线菌（actionmycetesactionmycetes）：原核微生物类群。）：原核微生物类群。 在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。 主要用于生产多种抗生素主要用于生产多种抗生素 发酵工程原理与技术8 工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物 p担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）：主要用于多）：主要用于多 糖、橡胶物

6、质和抗癌药物的开发。糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。 p藻类（藻类（algaalga）：许多国家已把它作为人类）：许多国家已把它作为人类 保健食品和饲料。还可通过藻类将保健食品和饲料。还可通过藻类将COCO2 2 转变为石油；国外还有从转变为石油；国外还有从“藻类农场藻类农场” 获得氢能的报道。获得氢能的报道。 发酵工程原理与技术9 发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育 p微生物菌种的分离微生物菌种的分离 p微生物菌种的选育微生物菌种的选育 发酵工程原理与技术10 微生物菌种的分离微生物菌种的分离 p施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法 p随机分离方法随机分离方法 发

7、酵工程原理与技术11 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法 富集培养富集培养 供给特殊培养基或加入某些抑制剂。供给特殊培养基或加入某些抑制剂。 培养方法培养方法 分批式富集培养分批式富集培养, ,连续富集培养连续富集培养 固体培养基固体培养基 发酵工程原理与技术12 p分批式富集培养（摇瓶培养）分批式富集培养（摇瓶培养） 重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可 将优势微生物分离出来。将优势微生物分离出来。 移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分

8、离方法 发酵工程原理与技术13 p连续富集培养：连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。 连续富集培养法可以筛选出能连续富集培养法可以筛选出能共共 生的稳定混合培养物生的稳定混合培养物，例如用甲，例如用甲 烷作碳源筛选到甲烷营养型和一烷作碳源筛选到甲烷营养型和一 些非甲烷营养型的共生菌。些非甲烷营养型的共生菌。 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法 发酵工程原理与技术14 固体培养基的使用固体培养基的使用 常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所

9、需的基常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所需的基 质，以便促使酶产生菌的生长。质，以便促使酶产生菌的生长。 举例：举例：产产碱性蛋白酶碱性蛋白酶的菌的分离。碱性土壤铺在的菌的分离。碱性土壤铺在 pH9pH91010的琼脂培养基的琼脂培养基( (含有均匀的不溶性蛋白质含有均匀的不溶性蛋白质) )表面。表面。 根据根据蛋白质水解圈的大小蛋白质水解圈的大小判断蛋白酶的产生能力。判断蛋白酶的产生能力。 施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法 发酵工程原理与技术15 有些微生物的产物对筛选没有任何选择性优势。因此有些微生物的产物对筛选没有任何选择性优势。因此 常需随机地分离。常需随机地分离。

10、随机分离方法随机分离方法 筛选！筛选！ 发酵工程原理与技术16 生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选 核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择 压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产 生菌。生菌。 例如：例如：通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长， 便可检出生长因子产生菌。便可检出生长因子产生菌。 随机分离方法随机分离方法-筛选筛选 发酵工程原理与技术17 抗生素产生菌筛选抗生素产生菌筛选 在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培

11、养基在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基 中，检测抗菌活性。中，检测抗菌活性。 随机分离方法随机分离方法-筛选筛选 发酵工程原理与技术18 药理活性化合物的筛选药理活性化合物的筛选 酶靶法：酶靶法： 基本原理：基本原理：一种化合物如在体外具有抑制代谢过程的一种化合物如在体外具有抑制代谢过程的 某一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用某一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用。 若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可 筛选出新的药理活性化合物。筛选出新的药理活性化合物。 随机分离方法随机分离方法-筛选筛选 发酵

12、工程原理与技术19 随机分离方法随机分离方法-筛选筛选 发酵工程原理与技术20 多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选 制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。 可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。 随机分离方法随机分离方法-筛选筛选 发酵工程原理与技术21 生物进化过程中野生型微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累 解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累 微生物育种的目的 方法：突变、体内重组方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）体外重组（基因工程） 微生物菌种的选育微生物菌种的选育 发酵工程原理与技术22

13、经典育种经典育种：自然选育自然选育和和诱变育种诱变育种 定向育种定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢 调控和基因工程等。调控和基因工程等。 微生物菌种的选育微生物菌种的选育 发酵工程原理与技术23 自然选育自然选育：利用菌种自然突变：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)(Spontaneous Mutation)进进 行菌种筛选的过程。行菌种筛选的过程。 自然突变自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应多因素低剂

14、量的诱变效应和和互变互变 异构异构效应。效应。 自然选育自然选育 发酵工程原理与技术24 多因素低剂量诱变效应多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原：自然突变实质上是由一些原 因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙 空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱 变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物 质质( (如如H H2 2OO2 2) )的作用等。的作用等。 自然突变自然突变 发酵工程原理与技术25 互变异构效应互变

15、异构效应：五种碱基五种碱基第六位上的酮基和氨基，第六位上的酮基和氨基， G G 和和T T可以酮式或烯醇式出现，可以酮式或烯醇式出现， A A 和和C C可以氨基或亚氨基形可以氨基或亚氨基形 式出现。式出现。 自然突变自然突变 N N NH N NH2 腺嘌呤腺嘌呤 (adenine, A) N N H N H N N H 2 O 鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G) 胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C) N N H N H 2 O 尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U) NH NH O O 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T) N H N H O O CH 3 发酵工程原理与技术26 嘌呤

16、嘌呤(purine) N N NH N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 N N NH N NH2 腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A) N NH NH N NH2 O 鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G) 发酵工程原理与技术27 N NH 1 3 2 4 5 6 嘧啶嘧啶(pyrimidine) 胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C) N NH NH2 O 尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U) NH NH O O 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T) NH NH O O CH3 发酵工程原理与技术28 五种碱基都能形成酮式五种碱基都能形成酮式- -烯醇式或氨基烯醇式或氨基- -亚氨基的互

17、变亚氨基的互变 异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。 HN HN C NH2+ O +HN NH2 N NH2 亚亚氨氨基基氨氨基基 + H+ N C OH N C O- + H+ 酮酮式式烯烯醇醇式式 互变异构效应互变异构效应 发酵工程原理与技术29 互变异构效应互变异构效应 p平衡倾向于酮式和氨基时，平衡倾向于酮式和氨基时，DNADNA双链中以双链中以ATAT和和GCGC碱碱 基对为主。基对为主。 p T T以烯醇式出现，在以烯醇式出现，在DNADNA复制到达该点的一瞬间，与复制到达该点的一瞬间，与 G G配对；配对； pC

18、C以亚氨基出现时，在新合成的以亚氨基出现时，在新合成的DNADNA单链的单链的C C点出现点出现A A p碱基对发生自然突变几率约碱基对发生自然突变几率约1010-8 -8 1010-9 -9。 。 发酵工程原理与技术30 结果：结果： 1 1、菌种衰退和生产质量下降；、菌种衰退和生产质量下降； 2 2、对生产有益的突变。、对生产有益的突变。 为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种( (复壮复壮) )。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落，实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落， 从中选从中选 出出稳定菌株稳定菌株用于生产。用于生产。 自然突变自然突变 发酵工

19、程原理与技术31 自然选育自然选育 p自然选育的优越性自然选育的优越性: :简单易行简单易行, ,可以达到纯化菌可以达到纯化菌 种种, ,防止菌种衰退防止菌种衰退, ,稳定生产稳定生产, ,提高产量的目的提高产量的目的. . p缺点缺点: :效率低效率低, ,进展慢进展慢, ,很难使生产水平大幅度提很难使生产水平大幅度提 高高. . 发酵工程原理与技术32 自然选育程序：自然选育程序： 把菌种制备成单孢子悬液，适当稀释，在平板上分把菌种制备成单孢子悬液，适当稀释，在平板上分 离，挑取单菌落进行生产能力测定，经反复筛选，以确离，挑取单菌落进行生产能力测定，经反复筛选，以确 定生产能力更高的菌株。

20、定生产能力更高的菌株。 自然选育自然选育 发酵工程原理与技术33 诱变育种理论基础：诱变育种理论基础：基因突变基因突变。 诱变育种诱变育种 发酵工程原理与技术34 自然突变：自然突变：自然条件下出现的基因突变。自然条件下出现的基因突变。 诱发突变诱发突变：用各种物理和生物因素、化学：用各种物理和生物因素、化学 因素人工诱发的基因突变。因素人工诱发的基因突变。 诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提 高高获得特性优良变异菌株的几率高。获得特性优良变异菌株的几率高。 发酵工程原理与技术35 诱变育种诱变育种主要步骤主要步骤 出发菌株的诱变处理出发菌株的诱变

21、处理 和和 突变体的筛选突变体的筛选。 发酵工程原理与技术36 出发菌株诱变处理出发菌株诱变处理 包括：包括： 出发菌株的选择出发菌株的选择 诱变剂的选择诱变剂的选择 诱变剂量和处理时间的确定诱变剂量和处理时间的确定 发酵工程原理与技术37 （1 1）出发菌株出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。 几个应注意的问题几个应注意的问题 发酵工程原理与技术38 （2 2）复合诱变因素的使用）复合诱变因素的使用 野生型菌株野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；用单一诱变因素有时能取得好效果；老老 菌种菌种单一诱变因素重复使用突变效

22、果不高，可利用复合单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。 青霉菌选育青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变，：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用再用UVUV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。获得高产菌株。 几个应注意的问题几个应注意的问题 发酵工程原理与技术39 乙烯亚胺和乙烯亚胺和UVUV复合处理，氯化锂和复合处理，氯化锂和UVUV复合处理，都复合处理，都 用得较普遍，且有一定成效。用得较普遍，且有一定成效。 氯化锂氯化锂本身无诱变作用，与

23、一些诱变因子一起使用时本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时 能促进突变。能促进突变。 几个应注意的问题几个应注意的问题 发酵工程原理与技术40 （3 3）剂量选择）剂量选择 变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一 定关系。定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据用致死率作为选择适宜剂量的依据。 合适剂量合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。：同时增加变异幅度与正突变。 几个应注意的问题几个应注意的问题 发酵工程原理与技术41 绝大部分个体死亡绝大部分个体死亡 少数存活少数存活 多数未变多数未变 少数突变少数突变 多数负变多数负变 少数正变少数正

24、变 多数幅度小多数幅度小 少数幅度大少数幅度大 多数不宜投产多数不宜投产 少数适宜投产少数适宜投产 存活率存活率 突变率突变率 正变率正变率 高产率高产率 投产率投产率 （4 4）变异菌株的筛选）变异菌株的筛选 诱变目的诱变目的：高产菌株、新产物。：高产菌株、新产物。 几个应注意的问题几个应注意的问题 发酵工程原理与技术42 突变体的筛选突变体的筛选 一般经初筛和复筛一般经初筛和复筛 初筛初筛：一般：一般定性定性，更多的是通过，更多的是通过平板平板采用变色圈、透明圈、采用变色圈、透明圈、 抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定某变异特性的某变异特性的 存在存在，粗略推

25、算出产量，有时也用液体培养。，粗略推算出产量，有时也用液体培养。 复筛：复筛：对初筛结果的菌株生产性能作比较精确的对初筛结果的菌株生产性能作比较精确的定量定量测定测定 还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产 发酵工程原理与技术43 1 2 3 1 1 2 3 初筛初筛 HC0 =HC1+ HC2 + HC3)HC0 =HC1+ HC2 + HC3) HC1 HC0能力增强能力增强) HC2 HC0能力减弱能力减弱) HC3= HC0能力不变能力不变) 1 1 2 3 3 HC0 =HC1+ HC2 + HC3)HC0 =HC1+ HC2 + HC3

26、) HC1 HC0能力增强能力增强) HC2 HC0能力减弱能力减弱) HC3= HC0能力不变能力不变) 1 2 3 3 发酵工程原理与技术44 发酵工程原理与技术45 诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程 中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态，中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态， 必须进行自然分离必须进行自然分离诱变育种和杂交育种必须环节。诱变育种和杂交育种必须环节。 自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。 发酵工程原理与技术46 第一轮：第一轮： 一个出发菌株一个

27、出发菌株选出选出200个菌株个菌株选出选出50株株 选出选出5株株 诱变处理 初筛 （每瓶一株） 复筛 （每瓶四株） 第二轮：第二轮： 5个出发菌株个出发菌株 选出选出50株株 选出选出5株株 40株株 40株株 40株株 40株株 40株株 诱变处理 初筛复筛 （每瓶一株）（每瓶四株） 发酵工程原理与技术47 饱浸含某种指示饱浸含某种指示 剂的固体培养基剂的固体培养基 的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固指示剂直接掺入或喷洒固 体培养基，菌落周围形成体培养基，菌落周围形成 变色圈。如淀粉的平皿上变色圈。如淀粉的平皿上 喷上稀碘液喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性固体培养基中渗

28、入溶解性 差、可被特定菌利用的营差、可被特定菌利用的营 养成分，造成不透明的培养成分，造成不透明的培 养基背景。菌落利用此物养基背景。菌落利用此物 质形成透明圈。质形成透明圈。 利用一些有特别营养要利用一些有特别营养要 求的微生物作为工具菌，求的微生物作为工具菌， 如待筛选菌具有该营养如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕能力，工具菌就能围绕 该菌生长该菌生长 待筛选的菌株能待筛选的菌株能 分泌产生某些能分泌产生某些能 抑制工具菌生长抑制工具菌生长 的物质的物质 发酵工程原理与技术48 营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型抗阻遏和

29、抗反馈突变型 特殊变异菌的筛选方法特殊变异菌的筛选方法 组成型突变株组成型突变株 抗（敏感）性突变株抗（敏感）性突变株 发酵工程原理与技术49 高丝氨酸缺陷菌生产高丝氨酸缺陷菌生产赖氨酸赖氨酸 必需氨基酸必需氨基酸 食品、医药、畜牧业需要量很大食品、医药、畜牧业需要量很大 但在但在代谢过程代谢过程中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制，中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制， 另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细 胞内累积胞内累积 高丝氨酸缺陷菌高丝氨酸缺陷菌（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝（不能合成高丝氨酸脱氢酶，

30、补充适量高丝 氨酸）则合成大量赖氨酸氨酸）则合成大量赖氨酸 发酵工程原理与技术50 天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸 磷酸磷酸 天冬氨酸天冬氨酸 半醛半醛 高丝氨酸高丝氨酸 苏氨酸苏氨酸 甲硫甲硫 氨酸氨酸 赖氨酸赖氨酸 AK HSDH C.glutamicum的代谢调节与赖氨酸生产的代谢调节与赖氨酸生产 为反馈抑制为反馈抑制为阻遏为阻遏 AK：天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 HSDH：高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶 发酵工程原理与技术51 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选 p淘汰野生型淘汰野生型 p检出缺陷型检出缺陷型 p鉴定缺陷型鉴定缺陷型 发酵工程原理与技术52 淘汰野生型淘汰野生型 原因：原因

31、： 营养缺陷型的比率很低，只有百分营养缺陷型的比率很低，只有百分 之几到千分之几，淘汰为数众多的之几到千分之几，淘汰为数众多的 野生型菌株，可达到野生型菌株，可达到“浓缩浓缩” ” 营养营养 缺缺 陷型的目的陷型的目的 方法：方法：抗生素法抗生素法或或菌丝过滤法菌丝过滤法 发酵工程原理与技术53 抗生素法抗生素法 原理：原理：抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，在基本培在基本培 养基上加抗生素养基上加抗生素，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不 死，从而来浓缩营养缺陷型死，从而来浓缩营养缺陷型 细菌细菌 通常通常 青霉素青霉素 （抑制细胞壁

32、的合成）（抑制细胞壁的合成） 真菌真菌 制霉菌素制霉菌素 （破坏真菌细胞膜）（破坏真菌细胞膜） 发酵工程原理与技术54 菌丝过滤法菌丝过滤法 原理：原理：在在基本培养基基本培养基上野生型发育成菌丝而营养缺陷上野生型发育成菌丝而营养缺陷 型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤 纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。 条件：条件：丝状真菌和放线菌丝状真菌和放线菌 发酵工程原理与技术55 检出缺陷型检出缺陷型 pA A夹层培养法夹层培养法 pB B逐个检出法逐个检出法 pC C影印培养法影印培养法 发酵工程原理与

33、技术56 夹层培养法夹层培养法 方法：方法：先倒一薄层不含菌先倒一薄层不含菌MMMM，冷凝后加上一层混有经过，冷凝后加上一层混有经过 诱变处理的菌液的诱变处理的菌液的MMMM，再浇一，再浇一薄层薄层不含菌不含菌MMMM，“三明三明 治治”，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四 层层CMCM培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开 始生长，菌落较小始生长，菌落较小 CM MM 培养皿侧面培养皿侧面 培养皿正面（新、小菌落培养皿正面（新、小菌落 即营养缺陷型）即营养缺陷型） 发酵工程原理与技术57

34、 逐个检出法逐个检出法 依次挑取菌落依次接种在依次挑取菌落依次接种在MMMM和和CMCM培养比较，在完全培养基培养比较，在完全培养基 的某一部位长出菌落而的某一部位长出菌落而MMMM不长，则是营养缺陷型不长，则是营养缺陷型 CM MM CM 营养缺陷型营养缺陷型 发酵工程原理与技术58 影印培养法影印培养法 完全培养基完全培养基 影印接种影印接种 基本培养基基本培养基 营养缺陷型营养缺陷型 发酵工程原理与技术59 营养缺陷型营养缺陷型 影印培养法影印培养法 发酵工程原理与技术60 鉴定缺陷型鉴定缺陷型 生长谱法生长谱法 发酵工程原理与技术61 生长谱法生长谱法 方法：方法： 营养缺陷型菌株与营

35、养缺陷型菌株与 MMMM以一定的浓度混合倒在以一定的浓度混合倒在 培养皿上，干燥后，在皿底培养皿上，干燥后，在皿底 画上若干区域，然后，在正画上若干区域，然后，在正 面加上微量的氨基酸、维生面加上微量的氨基酸、维生 素、嘌呤或嘧啶等营养物的素、嘌呤或嘧啶等营养物的 粉末或结晶（滤纸片法也粉末或结晶（滤纸片法也 可）。可）。 培养后，如果某一营养物的培养后，如果某一营养物的 周围有微生物的生长圈，说周围有微生物的生长圈，说 明它就是微生物的营养缺陷明它就是微生物的营养缺陷 型。型。 发酵工程原理与技术62 诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型 鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型 富

36、集培养富集培养 （抗生素法）（抗生素法） （菌丝过滤法）（菌丝过滤法） 夹层培养法夹层培养法 逐个检出法逐个检出法 影印平板法影印平板法 生长谱法生长谱法 营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法 发酵工程原理与技术63 反馈抑制和反馈阻遏反馈抑制和反馈阻遏 阻遏蛋白阻遏蛋白 操纵基因操纵基因 发酵工程原理与技术64 抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株 p结构基因突变，使结构酶无结合能力但结构基因突变，使结构酶无结合能力但 有催化活性；有催化活性；末端产物的积累末端产物的积累 p调节基因或操纵基因突变调节基因或操纵基因突变 p产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结

37、产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结 合，但不发生作用；合，但不发生作用；末端产物的积累末端产物的积累 发酵工程原理与技术65 抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选 方法方法： 末端产物结构类似物筛选；末端产物结构类似物筛选； 未突变者死，未突变者死， 突变为抗者生并产菌落突变为抗者生并产菌落 营养缺陷型回复突变株筛选。营养缺陷型回复突变株筛选。 活性复，结构改变活性复，结构改变 目标产物结构类似物 赖氨酸S-（2氨基乙基）-L 半胱氨酸-(AEC) 苏氨酸-氨基-羟基戊酸 （AHV) 异亮氨酸乙硫氨酸 精氨酸D-精氨酸 苯丙氨酸对氟苯丙氨酸 发酵工程原理与技术66

38、组成酶和诱导酶组成酶和诱导酶 组成酶组成酶 微生物有些酶总是适量地存在微生物有些酶总是适量地存在, ,它们是不依赖它们是不依赖 于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的 酶酶, ,如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。 诱导酶诱导酶 适应性酶适应性酶, ,是依赖于某种底物或底物的结构类是依赖于某种底物或底物的结构类 似物的存在而合成的酶。似物的存在而合成的酶。 发酵工程原理与技术67 i i基因基因P P OOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A 有乳糖时有乳糖时 调节蛋白亚基调节蛋白亚基 调节蛋

39、白调节蛋白 阻遏蛋白阻遏蛋白 RNARNA聚合酶聚合酶 i i基因基因P P OOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A 诱导物乳糖诱导物乳糖 无活性的无活性的 阻遏蛋白阻遏蛋白 转录转录 翻译翻译 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷通透酶半乳糖苷通透酶 -半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶 mRNAmRNA 没有乳糖时没有乳糖时 发酵工程原理与技术68 诱导酶弊端诱导酶弊端 诱导酶的生产需要诱导物，而诱导酶的生产需要诱导物，而 且受到诱导物的种类、数量以且受到诱导物的种类、数量以 及分解产物的影响。诱导物有及分解产物的影响。诱导物有 时又比较昂贵。时又比较昂贵。 能迅

40、速利用的碳源（如葡萄糖）能迅速利用的碳源（如葡萄糖） 会引起酶合成的减少会引起酶合成的减少. . 生产成本提高生产成本提高 发酵工程原理与技术69 组成型突变株组成型突变株 p突变发生在调节基因或操纵基因突变发生在调节基因或操纵基因, ,解除对诱导物解除对诱导物 的依赖的依赖, ,可获组成型突变株。可获组成型突变株。 p少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比 亲本高的多的酶，这种突变株称为亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株超产突变株。 发酵工程原理与技术70 i i基因基因P P OOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A

41、有乳糖时有乳糖时 调节蛋白亚基调节蛋白亚基 调节蛋白调节蛋白 阻遏蛋白阻遏蛋白 RNARNA聚合酶聚合酶 i i基因基因P P OOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A 诱导物乳糖诱导物乳糖 无活性的无活性的 阻遏蛋白阻遏蛋白 转录转录 翻译翻译 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷通透酶半乳糖苷通透酶 -半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶 mRNAmRNA 没有乳糖时没有乳糖时 发酵工程原理与技术71 p筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通 过菌落分辨。过菌落分辨。 加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物 交替培养法交替培养法

42、 显色反应法显色反应法 组成型突变株筛选组成型突变株筛选 发酵工程原理与技术72 组成型突变株筛选组成型突变株筛选 加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基如：加邻硝基-D-D-岩藻糖苷，抑制岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷半乳糖苷 酶合成。酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利 用乳糖，生长，被富集。用乳糖，生长，被富集。 发酵工程原理与技术73 组成型突变株筛选组成型突变株筛选 交替培养法交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养含诱导物（乳糖）中培养组成型组成型 快快不含诱导物（葡萄糖）中培养不含诱导物（葡萄糖）中培养 诱导型失酶诱导型失

43、酶反复。反复。 发酵工程原理与技术74 组成型突变株筛选组成型突变株筛选 显色反应法显色反应法 不含诱导物平板培养不含诱导物平板培养加底物加底物分分 解（有颜色变化）解（有颜色变化）检出。检出。 如如: :邻邻- -硝基苯酚半乳糖苷硝基苯酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)可被可被-半乳糖半乳糖 苷酶水解为半乳糖和黄色的邻苷酶水解为半乳糖和黄色的邻- -硝基苯酚硝基苯酚 （ONPONP） 发酵工程原理与技术75 抗（敏感）性突变株筛选抗（敏感）性突变株筛选 p包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量；抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； 条件抗性突变：如温度，可提高产量；条件抗性突变：如温度，可提高产量； （温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型） 发酵工程原理与技术76 抗（敏感）性突变株筛选抗（敏感）性突变株筛选 敏感突变：敏感突变： 如：柠檬酸如：柠檬酸-异柠檬酸异柠