分子诊断学：蛋白质组学（Proteomics）

1、蛋白质组学（蛋白质组学（Proteomics） Which is the origin of life？ 一、背景一、背景 二、基本概念（掌握）二、基本概念（掌握） 三、特点三、特点 四、内容和技术四、内容和技术 五、应用五、应用 omics？ 一、产生背景一、产生背景 1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。 2. 随着人类基因组全序列测定，但基因本身不足以解读复杂的随着人类基因组全序列测定，但基因本身不足以解读复杂的 生命现象。生命科学跨入了后基因组时代。生命现象。生命科学跨入了后基因组时代。 Genome 基因组研究是静态研究

2、，序列信息并不能告诉人们哪些基因在基因组研究是静态研究，序列信息并不能告诉人们哪些基因在 何时何地以何种程度表达，而生命的精确机制很大程度上正是何时何地以何种程度表达，而生命的精确机制很大程度上正是 基于这类基因的精确调控基于这类基因的精确调控。 Transcriptome mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性差。丰度与蛋白质丰度的相关性差。 mRNA自身存在贮存、自身存在贮存、 转运、降解、翻译调控及产物的翻译后加工，难以准确地反映转运、降解、翻译调控及产物的翻译后加工，难以准确地反映 基因的最终产物基因功能的真正执行体基因的最终产物基因功能的真正执行体蛋白质的质与量。蛋白质的质与量。 蛋白质存

3、在复杂的翻译后修饰（磷酸化、糖基化、乙酰化）。蛋白质存在复杂的翻译后修饰（磷酸化、糖基化、乙酰化）。 蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质蛋白质相互作用等也无法蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质蛋白质相互作用等也无法 从从mRNAmRNA水平来判断水平来判断 Proteome DNA mRNA Protein 1.蛋白质组（proteome） 是指特定细胞、组织、乃至机体作为一个生命单元中所有 蛋白的合集，即生命体中携带的基因信息在某一时间段所 表达的所有蛋白质。 2. 蛋白质组学（proteomics） 是对在特定时间和环境下所表达的群体蛋白质研究的一门 学问 二二. 概念概念 蛋白质组蛋白质组(

4、Proteome)一词最早由澳大利亚学者一词最早由澳大利亚学者 等于等于 1994年提出。年提出。 同基因组学一样同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的 知识体系知识体系,而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式表达模式 及功能模式及功能模式,其内容包括蛋白质的其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、定性鉴定、定量检测、细胞内定位、 相互作用研究相互作用研究等等,最终揭示蛋白质功能最终揭示蛋白质功能,是基因组序列与基因是基因组序列与基因 功能之间的桥梁。功能之间的桥梁。

5、三三. 蛋白质组学研究的特点蛋白质组学研究的特点 （1）整体性）整体性 生命活动依赖于各种蛋白的协调合作生命活动依赖于各种蛋白的协调合作 （2）揭示生命的动态性过程）揭示生命的动态性过程 同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也 是在不断改变的。在病理或治疗过程中，细胞蛋白是在不断改变的。在病理或治疗过程中，细胞蛋白 质的组成及其变化与正常生理过程的也不同。质的组成及其变化与正常生理过程的也不同。 （3）体现生命现象的复杂性）体现生命现象的复杂性 基因表达的精密多层次调控基因表达的精密多层次调控 Glucocorticoid receptor（G

6、R）, Coding Gene：NR3C1 四四. 蛋白质组学的研究内容及技术蛋白质组学的研究内容及技术 表达蛋白组学表达蛋白组学 （2-D电泳）电泳） 结构蛋白组学结构蛋白组学 （晶体结构分析）（晶体结构分析） 功能蛋白组学功能蛋白组学 （EMSA,COIP等）等） 五、蛋白质组研究的相关技术五、蛋白质组研究的相关技术 （一）蛋白质的分离（一）蛋白质的分离 1. 二维凝胶电泳（二维凝胶电泳（two dimensional electrophoresis， 2-DE）。）。 2. 操作操作 （1）等电聚焦）等电聚焦 凝胶电泳凝胶电泳 （2）SDS-PAGE电泳电泳 （3）图像分析）图像分析 （

7、二）（二）2-D胶上蛋白质鉴定和测序胶上蛋白质鉴定和测序 （1）早期）早期Western blot鉴定鉴定 （2）质谱技术）质谱技术 MS是样品分子离子化后，根据不同离子间的质量、电是样品分子离子化后，根据不同离子间的质量、电 荷比值差异来确定相对分子质量的技术。电喷雾离子荷比值差异来确定相对分子质量的技术。电喷雾离子 化（化（eletrospray ionozation，ESI）和基质辅助的激光）和基质辅助的激光 解吸离子化（解吸离子化（MALDI）。）。 （3） Edman降解法鉴定降解法鉴定 （4）蛋白质组信息学）蛋白质组信息学 Western Blotting Immunal Blot

8、ting 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相 应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜） 上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。 Northern印迹法 Western印迹法 免疫标记技术 Elisa Western Blotting Immunohistochemistry In situ hybridization 蛋白质转印 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） 固相免疫测定 SDS-PAGE 在缓冲液中添加 SDS 的电泳系统称为 S

9、DS(十二烷 基硫酸钠）胶片电泳 SDS 是一种离子性的界面活性剂,带强的负价，可 以使蛋白本身带的电荷忽略不计 决定不同蛋白质的泳动速率就只剩下分子大小一 项因素 转印/印记 蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝 胶中转移到硝酸纤维素膜（NC）或者PVDF膜上 三明治 封闭 印迹首先用蛋白溶液（如10的BSA/脱脂奶粉） 一抗特异性的结合抗原（一抗孵育） 二抗孵育 适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理 后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的 位置，即是待研究的蛋白质的位置。 显色/发光 印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理， 当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会

10、产生可见 的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。 比较蛋白的差异性表达 （三）蛋白质分子结构分析（三）蛋白质分子结构分析 1. 实际测定具体蛋白质的三维结构：实际测定具体蛋白质的三维结构：X-射线单晶衍射分析（晶射线单晶衍射分析（晶 体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重 构术（电子晶体学）。构术（电子晶体学）。 X-射线单晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。局限性：晶射线单晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。局限性：晶 体体 2. 通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构

11、（1）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理，）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理， 从理论上计算蛋白质分子的空间结构。从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 （2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与 空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。 1. 研究蛋白质组的高通量方法。分别收集细胞不同区域内研究蛋白质组的高通量方法。分别收集细胞不同区域内 蛋白质，然后进行蛋白质，然后进行2-D电泳和蛋白质鉴定。电泳和蛋白质鉴定。 2. 将胞内特定

12、蛋白质进行荧光标记，然后在荧光显微镜下将胞内特定蛋白质进行荧光标记，然后在荧光显微镜下 进行观察蛋白质移位。进行观察蛋白质移位。 （四）研究蛋白质胞内分布及移位的方法（四）研究蛋白质胞内分布及移位的方法 （1）凝胶滞后实验（）凝胶滞后实验（gel retardation） （2）DNA ase I 足纹分析（足纹分析（ DNA ase I footprinting） （3）核酸）核酸蛋白质杂交实验蛋白质杂交实验 （五）蛋白质（五）蛋白质核酸相互作用的研究核酸相互作用的研究 凝胶滞后实验（凝胶滞后实验（gel retardation） 凝胶滞后实验（凝胶滞后实验（gel retardation）

13、 DNA ase I 足纹分析（足纹分析（ DNA ase I footprinting） 核酸核酸蛋白质杂交实验（蛋白质杂交实验（southwestern blot） （六）蛋白质之间的相互作用（六）蛋白质之间的相互作用 蛋白质相互作用的基本形式蛋白质相互作用的基本形式 （1）分子和亚基的聚合）分子和亚基的聚合 （2）蛋白分子杂交）蛋白分子杂交 （3）分子识别）分子识别 （4）分子自我装备）分子自我装备 （5）多酶聚合体）多酶聚合体 蛋白质相互作用的检测方法蛋白质相互作用的检测方法 1.生化方法生化方法 共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析 蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某

14、种基质上（如 Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作 用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来 2.免疫的方法免疫的方法 免疫共沉淀（COIP） 3. 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 优点： （1）蛋白质不必纯化 （2）在活体内进行，能真实模拟在体的情况 （3）可以检测短暂或者微弱的相互作用 （4）可以用于分析不同功能的蛋白 缺点： （1）定位于核内 （2）假阳性 （3）需要进一步确证 蛋白质组学研究的应用蛋白质组学研究的应用 1. 用于寻找疾病相关的蛋白质：标志物。用于寻找疾病相关的蛋白质：标

15、志物。 2. 用于微生物蛋白组研究，彻底阐明病原微生物的致病机用于微生物蛋白组研究，彻底阐明病原微生物的致病机 理并寻找全新的药物作用靶点。理并寻找全新的药物作用靶点。 3. 蛋白质组数据库将成为药物设计的路标。蛋白质组数据库将成为药物设计的路标。 4. 对不同生物的蛋白质组进行比较性研究，可以对生物进对不同生物的蛋白质组进行比较性研究，可以对生物进 化途径提供参考，对多细胞生物的起源提供线索。化途径提供参考，对多细胞生物的起源提供线索。 5. 追踪胞内信号分子的移位，阐明目标蛋白质在信号转导追踪胞内信号分子的移位，阐明目标蛋白质在信号转导 途径中的位置。途径中的位置。 Screen the differentially expressed proteins 2-D Electrophoresis Screen the differentially expressed protein spots protein extract Collect specimens cancerNCM Biomarker for diagnosis treatment and prognosis MS( ESI-MS-MS) identification Unknown known verification 蛋白质组学