荧光实时定量PCR2014

1、荧光实时定量荧光实时定量PCRPCR 4 4 基本概念基本概念 化学原理化学原理 1 1 2 2 3 3 等位基因鉴定原理等位基因鉴定原理 数学原理数学原理 基本概念基本概念1 1 PCR 典型的典型的PCRPCR四阶段四阶段 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR PCR扩增反应中 对每一个循环产物荧光信号的实时检测 实现对起始模板定量和定性分析 在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质， 随着PCR反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度也等比增加。 通过检测荧光强度的变化，我们就可以得到荧光扩增曲线 R REALEAL- -TIMETIME PCR VS PCR PCR VS PCR

2、 1. 1.荧光染料掺入的原理？荧光染料掺入的原理？ 荧光强度与模板的数量成正比荧光强度与模板的数量成正比 2. 2.如何根据扩增曲线来进行模板的定量分析？如何根据扩增曲线来进行模板的定量分析？ 化学原理化学原理2 2 荧光实时定量荧光实时定量PCRPCR技术的产生技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EBEB加入PCR反应 体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green ISYBR Green I 取代 EB.EB. 荧光探针荧光探针杂交技术 两种定量化学两种定量化学 染料染色 SYBR Gre

3、en I EB 探针标记 Tagman 分子信标 染料染色染料染色 SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料 PCR过程中染料的掺入：信号强度与双链DNA分子数正比 扩增曲线扩增曲线 存在的问题存在的问题 引物扩增的是否是引物扩增的是否是单一单一的的目的基因目的基因？ 通过扩增曲线进行目的基因的定量分析通过扩增曲线进行目的基因的定量分析 检验方法：熔解曲线检验方法：熔解曲线 熔解曲线熔解曲线 PCR过程中，可控制温度缓慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec) dsDNA解链成为ssDNA SYBR Green I被释放，荧光信号消失 对熔解曲线求一阶导数，峰

4、值代表斜率改变最大值，即Tm Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量 有关，可部分代表序列的特异性 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 扩增曲线有效 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确 扩增曲线无效 熔解曲线熔解曲线 染料的特点染料的特点 探针标记探针标记 TaqmanTaqman探针探针 一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增有关。 探针5端连接荧光基团，3端连接淬灭基团。 利用了PCR延伸反应时，聚合酶的5外切酶活性， 使荧光基团和淬灭基团分离。 热变性，配对热变性，配对 聚合酶，延伸聚合酶，延伸 信号强度与

5、结合探针的信号强度与结合探针的DNADNA分子数成正比分子数成正比 荧光共振能量转移荧光共振能量转移(FRET)(FRET) Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 10nm 探针的特点探针的特点 方法方法优点优点缺点缺点适用范围适用范围 SYBR Green I SYBR Green I 方法方法 适用性广适用性广 灵敏灵敏 方便方便 便宜便宜 引物要求高引物要求高 易出现非特异性带易出现非特异性带 不能进行多重定量不能进行多重定量 适合科研中对各种目的适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因

6、表基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重达量的研究，转基因重 组动植物的研究组动植物的研究 TaqMan TaqMan 方法方法 特异性高特异性高 重复性好重复性好 多重定量多重定量 价格高价格高 只适合特定目标只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药病原体检测，疾病耐药 基因研究基因研究, ,药物疗效考核药物疗效考核 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 不同定量方法的比较不同定量方法的比较 数学原理数学原理 3 3 横坐标：横坐标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCycle） 纵坐标：纵坐标：荧光强度荧光强度 每个每个循环延伸步骤进行循环延伸步骤进行一次荧光信号的收集一次荧光信号的收集 扩增曲线

7、图扩增曲线图 理想的PCR反应： X=X0*2n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 在扩增产物达到定值M时: M= X0 *2 C log2 M=log2 (X0 *2 C) log2 M=log2 X0 +log22 C log2 M=log2 X0 +C 整理得: = - + log M C：产物到M值的循环数 = - + log M M:阈值 C(Cq/Ct)：产物到阈值的循环数 Log XLog X0 0（初始模板量）与（初始模板量）与 CtCt呈反比的线性关系。呈反比的线性关系。 公式的成立条件 理想的PCR X=X0*2n 非理想 X=X0*（1+

8、Ex）n 指数增长期（起飞阶段）设定阈值指数增长期（起飞阶段）设定阈值 1)不同样品间扩增效率的相对差异小 2)同一样品不同次的扩增效率的相对差异小 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定， 对数期 Ct值则极具重现性 2 2种定量目标种定量目标 检测起始模板数的精确 拷贝数 标准曲线法 病毒感染的定量监测 HIV RNA，HCV RNA 不同处理的样本之间基 因的表达差异 2 - Ct 双标准曲线法 药物处理对目的基因表 达的影响 病人和正常人目的基因 的差异 绝对定量绝对定量相对定量相对定量 绝对定量绝对定量标准曲线标准曲线 LogX0与Ct呈线性关系， 通过已知起始拷贝数的标准品可作

9、出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 相对定量内参相对定量内参 u在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来 标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异 u稳定内参 18S，b-Actin，GAPDH p在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受 环境因素影响小 p内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 双标准曲线法双标准曲线法 对目的基因和看家基因做两组标准曲线 待测样品目的基因的浓度 待测样品内参基因的浓度 . 对照样品目的基因的浓度 对照样品内参基因的浓度 考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正 扩增效率 目的基因处理前后变化= 1. 1.荧光染料掺入的原理？荧光染料掺入的原理？ 荧光强度与模板的数量成正比荧光强度与模板的数量成正比 2. 2.如何根据扩增曲线来进行模板的定量分析？如何根据扩增曲线来进行模板的定量分析？ 等位基因鉴定原理等位基因鉴定原理 4 4 双探针法双探针法 分析应用分析应用 基因表达的绝对定量分析 病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物基因拷贝 数检测 基因表达的相对定量分析 不同处理样本间特定基因表达差异，特定基因不同时