细胞培养完整手册（DOC）

1、细胞培养完整手册常用设备 准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、 ph 计（测量培养用液 ph 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ -80 ）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 co2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4 冰箱（放置 serum 和培养用液）。无菌操作基本技术 无菌

2、室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 过氧乙酸擦拭。2.co2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3 新洁尔灭擦拭，然后用 75 酒精擦拭或者 0.5 过氧乙酸，再用紫外灯照射。3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 。4.实验后灭菌：用 75 酒精（ 3 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 5.定期检测下列项目：钢瓶之co2 压力；co2培养箱之co2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管

3、及hepa 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/hepa)。6.水槽可添加消毒剂(zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75 酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示： 1.凡是带入超净工作台内的酒精、 pbs 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以上的使用液时要注

4、意更换吸管，防止交叉污染。 器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消： 一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干： 12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g ：浓硫酸 200ml ：蒸馏水 1000ml ）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖

5、好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅 时，维持 20-30 分钟。 7.高压消毒后烘干 二、旧的玻璃器皿的洗消： 1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。 2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液）， 12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。 3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关

6、和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向 15 磅 时，调节电开关维持 20-30 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上） 5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75 酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅 高压（ 30 分钟）消毒，再烘干备用。 橡胶和塑料： 橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再

7、用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 naoh 泡 6-12 小时 , 或者煮沸 20 分钟 , 在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上 ( 凹向上 ) ，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 2.胶塞烘干后用 2 氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 3.胶帽，离心管帽烘干后只能在 2 氢氧化钠溶

8、液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4.胶头可用 75 酒精浸泡 5 分钟，然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶，培养板，冻存管.6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70 酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用 23 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸

9、包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻 (coc126h2o) 2g ，30盐酸 10m 1，蒸馏水 88m1 。注意事项： 1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡： a. 泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人

10、体。 b. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。 c. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止 泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 ph 计、磁力搅拌器。 具体步骤：一、水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。二、pbs 的制备与消毒 ( 也可用于其它 bss ，如： hanks ， d-hanks 液的配制 ) ：1.溶解定容：将药品（ nacl 8.0g ， kcl 0.2g ， na2hpo4h2o 1.56g ， kh2po40. 2

11、g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ，摇匀即成新配制的 pbs 溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒：将 pbs 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 ph 为 8.0 、温度为 37 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度

12、造成细胞损伤。因 ca2+ 、 mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 ca2+ 、 mg2+ 的 bss ，如： d-hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 ph 到 7.2 左右）或 pbs （ d-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4 内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（ 0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20 保存以备使用。四、抗生素溶液的配制

13、1.所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅 高压 20 分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。 3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 1 单位 1 微克？ 4.细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.培养自atc引进之细胞株，培养基中不加抗生素。6.培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通 过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。7.寄送活细胞时，

14、须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml) 8.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。9.去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml 注意混合使用后药物毒性会增强。10.抗生素使用种类与浓度：工作浓度. 储存温度. 杀灭

15、细菌 penicillin 100 units/ml -20 g(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20g(+) and g(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 g(+) and g(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 g(+) and g(-) bacteria, mycoplasma amphotericin b 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2

16、.5ug/ml -20 yeast and molds 五、rpmi1640 的制备与消毒：1.溶解、调 ph 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml 。然后用一个当量的盐酸和 naoh 调 ph 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ，摇匀。 2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。

17、然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4 冰箱内待用。 5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4 时两周有效）。六、血清： 1.血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56 水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发

18、生污染或容器冻裂之情形。 2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3.瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 或70 至4冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般 50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡 ，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由 直接 至 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4.heat-inactivation 是指56 , 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补

19、体成份(complement) 去活化。除非必须，一般建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagytosis, chemotaxis and activation of lymphytic and macrophage cell type。5.勿将血清置于太久，若在 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会

20、因此受到破坏，而影响血清之品质。 6.血清之沉淀物 6.1 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。6.2 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是小黑点 ，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在中欲培养此微生物“，但在37 环境下，

21、又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品应立即停用，更换另一批号的血清。七、hepes 溶液： hepes 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（ n-a-hydroxythylpiperazine-n- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 ph 范围。使用终浓 度为 10-50mmol/l ，一般培养液内含 20mmol/lhepes 即可达到缓冲能力。 1mol/l hepe 缓冲液配制方法如下：准确称取 hepts 238.3g

22、 ，加入新鲜三蒸水定容至 1l 。过滤除菌，分装后 4 保存。 注意：因为现在市售 hepes 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 hepes 的终浓度仍然为 20m mol/l 。如：称取 4.766 克 hepes 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（ 20ml ）加入 1l 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。 八、谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不

23、稳定， 4 下放置 1 周可分解 50 ，故应单独配制，置于 -20 冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4 冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1 4mmol/l 。可以配制 200mmol/l 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/l 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶， -20 保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。 九、肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 5

24、0ug/ml 。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克 / 瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml （精确可加入 0.9ml ）即可。 十、型胶原酶： 0.1 型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为 型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶 -20 保存。 十一 、明胶溶液： 因为明胶难于过滤，所以配制 0.1 明胶溶液必须用无菌的 pbs 配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1 克

25、 （配成 100ml 溶液） 即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是 01. 的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入 50ml 小瓶中， 4 保存。注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 rpmi1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 ph 值最终为 7.2 ，可在配制时调 ph 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常

26、重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。r 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化

27、高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿

28、后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 ph是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 co2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（immortali

29、ty）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?196，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 细胞原代培养 一、原理将动物机体的各种组织从机体中取出

30、，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 edta）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 ?ud3 二、仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至 37），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37）材料：胎鼠或新生鼠试剂：1640培养基（含 20%小牛血清），0.25%胰酶，hanks液，碘酒三、操作步骤（一）胰酶消化法1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 23秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超

31、净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用 hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。附：hanks液配方：5m kh2po4 0.06g，nacl 8.0g，nahco3 0.35g，kcl 0.4g，葡萄糖 1.0g，na2hpo4h2o 0.06g，加 h2o至 1000mlg1 注：hanks液可以高压灭菌。4下保存。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用 hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入 56倍的 0.25%胰酶液，37中消化 2040分钟，每隔 5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5、加入 35ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰

32、酶抑制剂）。6、静置 510分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离心 10分钟，弃上清液。8、加入 hanks液 5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入培养液 l2 ml（视细胞量），血球计数板计数。10、将细胞调整到 5105/ml左右，转移至 25ml细胞培养瓶中，37下培养。上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。（二）组织块直接培养法自上方法第 3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组

33、织块。入 37静置 35小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37继续培养。四、注意事项1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。细胞传代培养（消化法）一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。二、材

34、料和试剂1.无菌磷酸生理缓冲液(dulbeccos phosphate-buffered saline, ca+/mg+ free, d-pbs, gibcobrl 21600-010) 2.trypsin-edta solution (0.05% trypsin-0.53mm edta-4na, gibcobrl 25300-062): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于20 ，使用前放在37 水槽回温。 3.新鲜培养基4.无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤（1）传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、pbs液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。 2

35、.用75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。（2）胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用pbs清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以

36、盖住细胞最好，最佳消化温度是37。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。（3）吹打分散细胞：1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。（4）分装稀释细胞：1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋

37、紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5105/ml。最后要做好标记。（5）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入co2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25时为一个，占50为，占75时为。*不同类型细胞操作*（1）附着型胞(adherent cell) 1.吸掉旧培养液。2.用d-pbs 洗涤细胞一至二次。3.加入trypsin-edta 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈

38、现圆粒状时，吸掉trypsin-edta 溶 液。(若不移去trypsin-edta，则在 trypsin-edta trypsin作用后，加入适量含血清 之新鲜培养基终止作用，离心后再吸掉上清液。4.轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。（2）悬浮型细胞(suspension cell) 1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。（3） 融合瘤(hybridoma

39、)有些 hybridoma cell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。*传代细胞培养注意事项*1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附：edta（0.02乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：edta 0.20g，nacl 8.00g， kcl 0.20g， kh2po4 0.02g， 葡萄糖 2.

40、00g，0.5酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节ph值到7.4。注意edta不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。 细胞计数及活力测定一、原理培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。计算细胞数目可用血球计数盘或是coulter counter 粒子计数器自动计数。 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9个1mm正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大

41、正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之erythrosi

42、n bluish 。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (gibcobrl 15250-061) erythosin bluish stain 取0.1 gram erythrosin bluish (sigma e-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (sigma h-3647) 溶于100 ml ca+/mg+ free saline 血球计数盘及盖玻片(hemytometer and coverslip) 计数器(counter)

43、 低倍倒立显微镜 粒子计数器(coulter counter, coulter electronics) 三、操作步骤（一）细胞计数3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 ( 或红色- erythrosin bluish) 。3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合

44、)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 3.4. 若不用血球计数盘，可用coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数x 2/ 410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色 2一 3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和

45、活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。范例：t75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22

46、 x 106 细胞数 /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/24392.6 % （三）mtt法测细胞相对数和相对活力活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 mtt分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。l、细胞悬液以 1000rpm离心 10分钟，弃上清液。2、沉淀加入 0.51ml mtt，吹打成悬液。3、37下保温 2小时。4、加入 45 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计 570nm比色，酸化异丙醇调零点。注意：mtt法只能测定细胞相对数和相对活力，

47、不能测定细胞绝对数。附：1、0.4%台盼兰染液配制：台盼兰 0.4克 加双蒸水至 100 ml。cbeqe 2、mtt配制：mtt 0.5克，溶于 100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4下保存。3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入 hcl使最终达 0.04mol/l。细胞的冷冻保存1.注意事项： 1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 90 致密度。1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。不宜将冻存细胞放置在0-60这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“

48、危险温区”。1.3.注意冷冻保护剂之品质。dmso 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron fglp telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如sigma d-2650)，以510 ml 小体积分装，4 避光保存，勿作多次解冻。使用dmso前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，dmso对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。1.4.冷冻保存之细胞浓度：1.4.1.normal human fibr

49、oblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2.hybridoma: 13 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些ybridoma 会因冷冻 浓度太高而在解冻24 小时后死去。1.4.3.adherent tumor lines: 57 x 106，依细胞种类而异。adenarcinoma 解冻后须较高之浓度，而hela 只需1-3 x 106 cells/ml。 1.4.4.other suspensions: 510 x 106 cells/ml, human lymphyte须至少5 x 106 cells/ml1.5.冷冻保护剂浓度为5 或10 dmso，

50、若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。1.6.冷冻方法：1.6.1.传统方法： 4 10分钟-20 30分钟- -80 16-18小时（或隔夜）-液氮槽vapor phase 长期储存。1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以1 -3 /分钟之速度由室温降至120 ，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 2.材料2.1.生长良好之培养细胞 2.2.新鲜培养基 2.3.dmso (sigma d-2650) 2.4.无菌塑料冷冻保存管(nalgene 5000-0020) 2.5

51、.0.4 w/v trypan blue (gibcobrl 15250-061) 2.6.血球计数盘与盖玻片 2.7.等速降温机(kryo 10 series ii) 3.步骤： 3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将dmso 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10 ，混合均匀，置于室温下待用。 3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。3.5.冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 10 分钟 -20 30 分钟 -80 1618 小时(或隔夜) 液氮槽vapor phase 长期储存。3.6.冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: hb cell 细胞活化、细胞复苏1.收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。