基因编辑方法CRISPR-Cas9

1、CRISPR-Cas9一种新型基因编辑一种新型基因编辑 方法方法 又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异 性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。 方法包括： 锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术 转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术 Cas9/gRNA 系统系统(CRISPR-cas9技术技术) 基因组编辑技术基因组编辑技术 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶

2、都依赖于 DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切 酶 (Fok) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位， DNA切割域剪切。 锌指核酸酶（锌指核酸酶（ZFN）转录激活因子）转录激活因子 样效应物核酸酶（样效应物核酸酶（TALEN）技术）技术 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9 技术技术 原理：规律性重复短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs） CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一

3、种适应性免疫防御机制，研究者根据 CRISPR-Cas 系统的特 性对此系统进行改造产生了第 3 代人工核酸内切酶技术 CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的 RNA 介导对入侵的 核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、 降解。 CRISPR-Cas9 技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有 效基因组编码工具。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure4 CRISPR-Cas9 技术技术 从已知的序从已知的序 列中通过列中通过 PAM 进行进行 定位寻找合定位寻找合 适的靶位点适的靶位点 并合成并合成 gRNA 构建构建gRNA 与与/Cas9 重重 组质

4、粒。组质粒。 对重组质粒对重组质粒 进行活性检进行活性检 测，敲除活测，敲除活 性的计算性的计算 挑选活性较挑选活性较 高的敲除质高的敲除质 粒导入培养粒导入培养 的细胞或者的细胞或者 生物体内进生物体内进 行基因组定行基因组定 点编辑操作点编辑操作 利用测序、利用测序、 RFLP 等方等方 法检测基因法检测基因 组定点修饰组定点修饰 结果结果 sgRNA 的设计的设计 选择 PAM（NGG）5端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即 敲除的靶位点。(PAM，Protospacer adjacent motifs 原间隔序列 临近基序。一般形式为 NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵 的噬菌

5、体或质粒的 DNA 序列中) 原则： 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一， 否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。 优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重 复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基 的缺失）。 PAM 的5端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测） 构建重组质粒构建重组质粒 构建方案 ： 1.一是将gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载 体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于 药物筛选） 。 2.二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携

6、带有不同 的荧光报告基因或抗性基因 载体选择： 慢病毒载体 以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基 因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的 传代表达。 gRNA的活性检测的活性检测 限制性内切酶法限制性内切酶法 当 Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果 通过 Cas9/sgRNA 发生突变，这个位点将可能被破坏，而不能被 内切酶 酶切。可采用电泳的方法估计突变效率， 以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。 非配对内切酶法非配对内切酶法 T7 核 酸 内 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能够识别

7、不完全配 对 DNA 并对其进行切割，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组 DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA的 PCR 产物等量混合， 并退火杂交，将产生非配对DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪切。 用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。 SSA 活性检测活性检测 一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP） 就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的靶 点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA 的作用下，靶点位置

8、产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的luciferase。 通过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。 降低降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法脱靶率的方法 Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条 DNA单链的切割。任一亚基的失活都将形成DNA单链断裂（nicked DNA）。 当结合于两条互补的 DNA 链上相邻位置的一对 sgRNA 同 时引 导 Cas9 D10A 识别并切割靶位点时才能造成 DSB，从而加大了识别的长度， 有效的提高了 Cas9-sgRNA 技术的特异性。 Cell 2014 157,

9、1262-1278 Figure6A,B 重组质粒导入细胞重组质粒导入细胞/生物体生物体 C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。 D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转 基因动物模型。 E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特 定时间，组织的基因编辑。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E CRISPR-Cas9技术的应用进展技术的应用进展 1. CRISPR/Cas 系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台 Cas9-sgRNA 在靶位点切

10、割产生DSB后， 细胞可以通过两种方式对 DNA 进行修复， 非同源末端连接 （non-homologous endjoining，NHEJ） 修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。 NHEJ 往 往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown。 而HDR往往通过供体 DNA 与基因组 DNA 之间的同源重组造成靶位点的纠 正或者靶向插入外源基因Knockin。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9技术的应用进展技术的应用进展 2. 利用利用 Cas9 系统在转录水平对基因

11、表达的调节系统在转录水平对基因表达的调节 通过点突变使 Cas9 蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得 dCas9，将 dCas9-sgRNA 作为与 DNA 特异性识别的平台，令转录因子或 表观调控酶与dCas9-sgRNA 融合表达，即可实现转录水平对基因表达的调 节。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6G CRISPR-Cas9技术的应用进展技术的应用进展 3. 利用利用 Cas9 系统对目标系统对目标 RNA 序列进行操纵序列进行操纵 CRISPR/Cas 蛋白亚型（型）被证明可以靶向消化 RNA 底物。预 示着该技术的发展将会代替shRNA/siRN

12、A 等传统 RNAi技术成为一种新型 的 RNA 干扰物而对不同种类的细胞及动物模型中特定的基因的下游产物进 行RNA 干扰。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure4截图 CRISPR-Cas9技术的应用进展技术的应用进展 4. 利用利用 Cas9 系统对基因组功能进行筛查系统对基因组功能进行筛查 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6F CRISPR-Cas9技术的应用进展技术的应用进展 5. Cas9 系统作为系统作为DNA特定位点标签特定位点标签 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6H Cas9和GFP融合表达，

13、可动态记录胞内DNA特定位 点的染色体结构状态 。 CRISPR-Cas9技术的应用进展技术的应用进展 6.利用利用 Cas9 系统可实现对基因的诱导调控系统可实现对基因的诱导调控 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6I 通过化学或可控因素诱导Cas9肽片段的重建，实现对基 因的诱导调控。 展望展望 到目前为止对 CRISPR/Cas9 技术的开发尚属初步。虽然 Cas9 系 统会被 sgRNA 引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在，特异 性仍待提高。 与成熟的 ZFN 和 TALEN 等遗传物质靶向编辑系统相比， CRISPR/Cas9 核酸内切酶系统具有构建简单方便快捷、安全性高、 毒性小等得天独厚的优越性，势必将在临床治疗、基础理论研究和 农牧渔业等领域发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基 因治疗领域产生深远的影响。 参考文献参考文献 1 Patrick D. Hsu, Eric S. Lander,and Feng Zhang.Development and Applications ofCRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell .2014 (157):1262-1278. 2 左其生等. CRISPR-Cas 介导