生物化学技术补充吸收光谱分析法

1、概念及分类概念及分类 u概念概念 利用各种化学物质具有发射、吸收或散射光谱谱系利用各种化学物质具有发射、吸收或散射光谱谱系 的特征，来确定物质性质、结构或含量的技术的特征，来确定物质性质、结构或含量的技术 u分类分类（根据物质对光谱响应特征的不同，可将其分为）（根据物质对光谱响应特征的不同，可将其分为） 发射光谱分析技术发射光谱分析技术 吸收光谱分析技术吸收光谱分析技术 散射光谱分析技术散射光谱分析技术 在生化技术方面，光谱分析是一类十分重要的技术，应在生化技术方面，光谱分析是一类十分重要的技术，应 用极为广泛；它既可以研究物质的结构，也可以对特定物质用极为广泛；它既可以研究物质的结构，也可以

2、对特定物质 进行定性或定量分析进行定性或定量分析 一、吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法 吸收光谱吸收光谱 是指波长连续分布的光透过物质时，某些波是指波长连续分布的光透过物质时，某些波 长的光被物质吸收而产生暗线或暗带组成的光谱长的光被物质吸收而产生暗线或暗带组成的光谱 吸收光谱分析法吸收光谱分析法 利用吸收光谱对物质进行定量的技术称利用吸收光谱对物质进行定量的技术称 为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一 特点特点 它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛 分类分类 目前最常应用的技术有目前最常应用的

3、技术有可见可见紫外分光光度法紫外分光光度法和和 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 ( (一一) )可见可见- -紫外分光光度法紫外分光光度法 1.1.原理原理 L-BL-B尔定律尔定律 （可见（可见- -紫外光区波长为紫外光区波长为200200760nm760nm，其中，其中200200400nm400nm为紫外光）为紫外光） 2.2.方法方法 对比法对比法 标准曲线法标准曲线法 lCEA cm %1 1 3.3.排除干扰的方法排除干扰的方法 当两种或两种以上的组分共存时，可出现吸收光谱重叠当两种或两种以上的组分共存时，可出现吸收光谱重叠 的情况；测定某一组分时，其他组分对它会有不同程度的

4、的情况；测定某一组分时，其他组分对它会有不同程度的 干扰，此时可采用干扰，此时可采用双波长法双波长法排除杂质的干扰排除杂质的干扰 吸收光谱相互重叠的吸收光谱相互重叠的a a、b b两组分。选择各自的测得波长两组分。选择各自的测得波长 1 1和和2 2，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相同，而，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相同，而 欲测组分在两波长处的吸光系数有显著的区别。用这样两欲测组分在两波长处的吸光系数有显著的区别。用这样两 个波长测得混合物溶液的个波长测得混合物溶液的吸光度差值吸光度差值AA，只与欲测组分的，只与欲测组分的 浓度成正比，而不受共存组分的影响浓度成正比，而不受共存组

5、分的影响 在测得波长在测得波长1 1和和2 2处测得混合物的吸光度分别是处测得混合物的吸光度分别是A A1a+b 1a+b和 和A A2a+b 2a+b， ， 则则AAa+b a+b=A =A1 1a+b a+b - A - A2 2a+b a+b = A = A1 1a a + A A1 1b bA A2 2a aAA2 2b b =A =Aa a +A +Ab b 因组分因组分a a在在1 1和和2 2处的吸光系数相等，即处的吸光系数相等，即 欲测组分欲测组分b b在两波长处的吸光系数相差愈大，则灵敏度愈高。在两波长处的吸光系数相差愈大，则灵敏度愈高。 用双波长法还能消除样品溶液背景吸收的

6、干扰和混浊的干扰，提用双波长法还能消除样品溶液背景吸收的干扰和混浊的干扰，提 高测定的准确性。近年来由于新的、灵敏度高、选择性好的显色高测定的准确性。近年来由于新的、灵敏度高、选择性好的显色 剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定；还剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定；还 可采用联立方程法、等吸收点法等解决定量中的干扰问题可采用联立方程法、等吸收点法等解决定量中的干扰问题 bbbbbbba aaaaba CCAA CA )( , 0)( 21 2121 因此上式可写成 ，故 3.3.分光光度计的光源检查和波长校正分光光度计的光源检查和波长校正 (1)(1)光源检

7、查即波长的初步检查光源检查即波长的初步检查 不论何种分光光度计在校正之前都要先检查光源。检查不论何种分光光度计在校正之前都要先检查光源。检查 方法是将波长选定在方法是将波长选定在580nm580nm处，将狭缝开到最大处，将狭缝开到最大( (或打开光或打开光 门门) )，打开钨灯，在比色皿内插一白纸片。光源正常时，应，打开钨灯，在比色皿内插一白纸片。光源正常时，应 看到看到均匀的黄色光斑均匀的黄色光斑，边缘清晰整齐；如果明暗不匀，形状，边缘清晰整齐；如果明暗不匀，形状 异常，则应调节光源灯的位置异常，则应调节光源灯的位置 常用的方法有常用的方法有 用含某些特定元素的玻璃来较正用含某些特定元素的玻

8、璃来较正 最常用的有最常用的有镨钕玻璃镨钕玻璃、钬、钬 玻璃等。校正时将这种玻璃放在比色皿座上，以空气调玻璃等。校正时将这种玻璃放在比色皿座上，以空气调0 0，测，测 定几个吸收峰值的波长是否相符。如最常用的测定定几个吸收峰值的波长是否相符。如最常用的测定镨钕滤光片镨钕滤光片 在在585nm585nm的杂光水平应在的杂光水平应在5%5%以内以内 可利用某些标准溶液进行校正可利用某些标准溶液进行校正 如标准重铬酸钾溶液如标准重铬酸钾溶液( (在在 1000ml1000ml的的0.05mol0.05molL L的的KOHKOH溶液中溶解溶液中溶解0.0400g0.0400g纯重铬酸纯重铬酸 钾钾(

9、K(K2 2CrOCrO4 4)，在，在2525以以1cm1cm比色皿在各波长测定其标准吸光比色皿在各波长测定其标准吸光 度，如表度，如表2 21 1。重铬酸钾溶液的优点是在紫外区。重铬酸钾溶液的优点是在紫外区270nm270nm及及370nm370nm 处有两个最大吸收处有两个最大吸收 (2)(2)波长校正波长校正 ( (二二) )原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 1.1.原理原理 基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化 器被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射特器被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射

10、特 征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量 2.2.方法方法 标准曲标准曲 线法、直接比较法和标准加入法线法、直接比较法和标准加入法 主要用于钙、镁、铜、铅、锌等微量元素的测定主要用于钙、镁、铜、铅、锌等微量元素的测定 3.3.原子吸收分光光度计结构特点原子吸收分光光度计结构特点 有单光束型和双光束型两类。主要由光源、原子化器、单有单光束型和双光束型两类。主要由光源、原子化器、单 色器和检测系统组成色器和检测系统组成 在微量元素测定中，首先根据有关资料了解仪器待测元素的灵敏度在微量元素测定中，首先根据有关资料了解仪器待测元素的灵敏度 和检出限和检出限

11、对灵敏度达不到要求的可以选择最灵敏的吸收线，选用小的狭缝对灵敏度达不到要求的可以选择最灵敏的吸收线，选用小的狭缝 宽度，采用较小的灯电流和最佳火焰类型及状态等来提高灵敏度宽度，采用较小的灯电流和最佳火焰类型及状态等来提高灵敏度 测定物质溶解后干扰要小，易于喷雾和原子化，稀释后测定结果测定物质溶解后干扰要小，易于喷雾和原子化，稀释后测定结果 应在线性范围内应在线性范围内 仪器通电后要预热仪器通电后要预热30min30min，使光源的发射稳定。狭缝的宽度影响，使光源的发射稳定。狭缝的宽度影响 光的谱带宽度与检测器的接受能量，使用较宽的狭缝可以增加光强度，光的谱带宽度与检测器的接受能量，使用较宽的狭

12、缝可以增加光强度， 提高信噪比，改善检出限提高信噪比，改善检出限 当吸收线附近有干扰谱线与非吸收光存在时，使用较宽的狭缝会当吸收线附近有干扰谱线与非吸收光存在时，使用较宽的狭缝会 降低灵敏度。在火焰化法中，火焰的类型是影响原子化效率的主要因降低灵敏度。在火焰化法中，火焰的类型是影响原子化效率的主要因 素。因此，需通过调节燃气与助燃气的流量获得最佳原子化条件，以素。因此，需通过调节燃气与助燃气的流量获得最佳原子化条件，以 达到最高的测定灵敏度达到最高的测定灵敏度 总之，一种元素的原子吸收法测定需要考虑仪器工作的各种条件，总之，一种元素的原子吸收法测定需要考虑仪器工作的各种条件， 以期达到实验的最

13、佳结果以期达到实验的最佳结果 二、发射光谱分析法二、发射光谱分析法 基本概念基本概念 荧光荧光 某些物质吸收了一定波长的光能后，独自从基态跃迁到激发某些物质吸收了一定波长的光能后，独自从基态跃迁到激发 态，此类分子经与同类或其他类分子相互碰撞，消耗相当，而下态，此类分子经与同类或其他类分子相互碰撞，消耗相当，而下 降至第一电子激发态的最低振动能阶。最低能阶下降到基态，同降至第一电子激发态的最低振动能阶。最低能阶下降到基态，同 时发射出较原来所吸收的频率低、波长长的光能，称为荧光时发射出较原来所吸收的频率低、波长长的光能，称为荧光 荧光分析法荧光分析法 对荧光物质进行定量测定的方法对荧光物质进行

14、定量测定的方法 发射光谱分析法分类发射光谱分析法分类 荧光分析法荧光分析法 火焰光谱法火焰光谱法 ( (一一) )荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理 1.1.原理原理 利用元素的原子所发射的共振荧光波长的差异，可确定元利用元素的原子所发射的共振荧光波长的差异，可确定元 素的种类或物质分子中某种结构，据荧光的强弱可以测定物质素的种类或物质分子中某种结构，据荧光的强弱可以测定物质 的含量的含量 2.2.方法方法 荧光分析定量是基于荧光物质的稀溶液，在一定的温度下，荧光分析定量是基于荧光物质的稀溶液，在一定的温度下， 当激发光的波长、强度、荧光测定波长以及液层厚度一定时，当激发光的波长、强度、荧光

15、测定波长以及液层厚度一定时， 所测得的荧光强度所测得的荧光强度F F与该溶液中荧光物质的浓度与该溶液中荧光物质的浓度C C成正比，即成正比，即 F=kCF=kC。采用。采用标准曲线法标准曲线法或或标准对照法标准对照法，对荧光物质进行定量。，对荧光物质进行定量。 在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强 （荧光分析的灵敏度比分光度法高，通常可达（荧光分析的灵敏度比分光度法高，通常可达1010-13 -13g g L L，对特，对特 定物质甚至可达到定物质甚至可达到1010-15 -15g g L L ） ( (二二) )影响荧光

16、分析的因素影响荧光分析的因素 1.溶剂溶剂 配制溶液的溶剂除水外，常用的乙醇、环己烷、四氯化碳、氯仿、丙配制溶液的溶剂除水外，常用的乙醇、环己烷、四氯化碳、氯仿、丙 酮等溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须经过重蒸馏等净化处理才能酮等溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须经过重蒸馏等净化处理才能 使用使用 2.荧光物质的浓度荧光物质的浓度 荧光强度与溶液的线性关系荧光强度与溶液的线性关系只限于很稀的溶液只限于很稀的溶液，符合下列方程：，符合下列方程： F=kCI0，式中，式中F为荧光强度，为荧光强度，C为溶液的浓度，为溶液的浓度，I0为激发光强度，为激发光强度，k为荧为荧 光效率。对于较浓的溶液

17、，荧光强度并不随浓度增大而增加，相反，却随光效率。对于较浓的溶液，荧光强度并不随浓度增大而增加，相反，却随 溶液浓度增大而下降。溶液浓度增大而下降。当荧光物质浓度高时，分子间碰撞增加，使荧光当荧光物质浓度高时，分子间碰撞增加，使荧光 强度减弱强度减弱；另外，；另外，浓度较大时，激发光被表面的荧光物质所吸收，产生浓度较大时，激发光被表面的荧光物质所吸收，产生 强烈的荧光，以致使后面的溶液不易受照射而不发光强烈的荧光，以致使后面的溶液不易受照射而不发光 3.温度温度 大多数情况下，温度升高，分子间碰撞次数便增加，消耗分子的内部大多数情况下，温度升高，分子间碰撞次数便增加，消耗分子的内部 能量而产生

18、自熄灭现象；温度降低时，则荧光强度增大能量而产生自熄灭现象；温度降低时，则荧光强度增大 ( (三三) )荧光分析技术的应用荧光分析技术的应用 荧光分析法灵敏度高、取样量少，广泛应用于各领域，在荧光分析法灵敏度高、取样量少，广泛应用于各领域，在 生化技术领域主要用于糖类、胺类、甾族化合物、生化技术领域主要用于糖类、胺类、甾族化合物、DNADNA与与RNARNA、 酶与辅酶、维生素等物质的分析酶与辅酶、维生素等物质的分析 测定荧光强度常用荧光分光光度计，它主要包括激发光源、测定荧光强度常用荧光分光光度计，它主要包括激发光源、 一对单色器、比色杯和检测器等部件一对单色器、比色杯和检测器等部件 荧光物

19、质的激发光谱和荧光光谱荧光物质的激发光谱和荧光光谱 激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱 激发光谱（吸收光谱）激发光谱（吸收光谱） 荧光物质吸收紫外光后被激发出荧光，如果将激发光的荧光物质吸收紫外光后被激发出荧光，如果将激发光的 光源用单色器使其分光后，测定在每一波长的激发光照射光源用单色器使其分光后，测定在每一波长的激发光照射 下，物质发射的荧光，以荧光强度对激发光波长作图，得下，物质发射的荧光，以荧光强度对激发光波长作图，得 到荧光物质的激发光谱到荧光物质的激发光谱 荧光光谱（发射光谱）荧光光谱（发射光谱） 如果使激发光的波长和强度保持不变，而让物质所发生如果使激发光的波长和强度保持不变，

20、而让物质所发生 的荧光通过单色器色散，依次将不同波长的荧光照射到单的荧光通过单色器色散，依次将不同波长的荧光照射到单 色器上，并依次测定其荧光强度，然后以荧光强度对相应色器上，并依次测定其荧光强度，然后以荧光强度对相应 的荧光作图，得到该物质的荧光发射光谱的荧光作图，得到该物质的荧光发射光谱 三、散射光谱分析法三、散射光谱分析法 散射光谱分析法散射光谱分析法 测定光通过溶液混悬颗粒后的吸光度或光散射程度的一类定量方法测定光通过溶液混悬颗粒后的吸光度或光散射程度的一类定量方法 散射比浊法散射比浊法 是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原抗体复

21、合物抗原抗体复合物 粒子，光线被粒子颗粒粒子，光线被粒子颗粒折射折射，发生，发生偏转偏转，光线偏转的角度与发射光的波，光线偏转的角度与发射光的波 长以及抗原抗体复合物颗粒大小、数目密切相关。长以及抗原抗体复合物颗粒大小、数目密切相关。散射光的强度与复合散射光的强度与复合 物的含量成正比物的含量成正比 透射比浊法透射比浊法 是测定一定体积的溶液通过的光线量是测定一定体积的溶液通过的光线量( (光通量光通量) )，当光线通过时，由，当光线通过时，由 于溶液中存在于溶液中存在抗原抗原抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光 的减少的减少，测得的，测得的

22、光通量和抗原抗体复合物的量成反比光通量和抗原抗体复合物的量成反比 发射光谱分析法发射光谱分析法 ( (一一) )散射免疫比浊分析散射免疫比浊分析 1 1散射颗粒与散射光的关系散射颗粒与散射光的关系 悬浮在反应溶液中的分子，悬浮在反应溶液中的分子， 无论是固体还是胶体粒子都可以无论是固体还是胶体粒子都可以 是散射中心。当入射光通过时，是散射中心。当入射光通过时， 如果颗粒直径比入射光的波长小如果颗粒直径比入射光的波长小 很多，则散射光比较均匀的分布很多，则散射光比较均匀的分布 于颗粒的四周，称为于颗粒的四周，称为RayleighRayleigh散散 射射；如果颗粒直径远远地大于入；如果颗粒直径远

23、远地大于入 射光的波长，则散射光的分布呈射光的波长，则散射光的分布呈 明显不匀称为明显不匀称为MieMie散射散射 2.反应物含量与散射浊度反应物含量与散射浊度 抗原抗原抗体结合反应中，遵守典型的抗体结合反应中，遵守典型的HeidelbergerHeidelberger曲线曲线 ( (二二) )免疫透射比浊分析免疫透射比浊分析 原原 理理 试验中设计检测试验中设计检测抗体抗体过量，待测样品中的过量，待测样品中的IgIg在反应介质中在反应介质中 与相应的检测抗体发生与相应的检测抗体发生抗原抗原抗体抗体反应，形成不溶性反应，形成不溶性复合物复合物， 在聚乙二醇在聚乙二醇(PEG)(PEG)的作用下

24、，加速抗原的作用下，加速抗原- -抗体复合物的形成并增抗体复合物的形成并增 加其稳定性，使加其稳定性，使反应介质的浊度发生改变反应介质的浊度发生改变，利用分光光度计测，利用分光光度计测 定光线被吸收的量，待测定光线被吸收的量，待测样本的抗原含量与吸光度成正比，光样本的抗原含量与吸光度成正比，光 通量与抗原含量成反比通量与抗原含量成反比。利用标准品做出标准曲线，待测样本。利用标准品做出标准曲线，待测样本 的浊度变化在标准曲线上计算出来的浊度变化在标准曲线上计算出来 一、吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法 吸收光谱吸收光谱 是指波长连续分布的光透过物质时，某些波是指波长连续分布的光透过物质时，某些波

25、 长的光被物质吸收而产生暗线或暗带组成的光谱长的光被物质吸收而产生暗线或暗带组成的光谱 吸收光谱分析法吸收光谱分析法 利用吸收光谱对物质进行定量的技术称利用吸收光谱对物质进行定量的技术称 为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一 特点特点 它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛 分类分类 目前最常应用的技术有目前最常应用的技术有可见可见紫外分光光度法紫外分光光度法和和 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 ( (一一) )荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理 1.1.原理原理 利用元素的原子所发射的共

26、振荧光波长的差异，可确定元利用元素的原子所发射的共振荧光波长的差异，可确定元 素的种类或物质分子中某种结构，据荧光的强弱可以测定物质素的种类或物质分子中某种结构，据荧光的强弱可以测定物质 的含量的含量 2.2.方法方法 荧光分析定量是基于荧光物质的稀溶液，在一定的温度下，荧光分析定量是基于荧光物质的稀溶液，在一定的温度下， 当激发光的波长、强度、荧光测定波长以及液层厚度一定时，当激发光的波长、强度、荧光测定波长以及液层厚度一定时， 所测得的荧光强度所测得的荧光强度F F与该溶液中荧光物质的浓度与该溶液中荧光物质的浓度C C成正比，即成正比，即 F=kCF=kC。采用。采用标准曲线法标准曲线法或或标准对照法标准对照法，对荧光物质进行定量。，对荧光物质进行定量。 在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强 （荧光分析的灵敏度比分光度法高，通常可达（荧光分析的灵敏度比分光度法高，通常可达1010-13 -13g g L L，对特，对特 定物质甚至可达到定物质甚至可达到1010-15 -15g g L L ） 荧光物质的激发光谱和荧光光谱荧光物质的激发光谱和荧光光谱 三、