RT-qPCR(实时荧光定量PCR).

1、Add Your Company Slogan 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术 RealTime QuantitativePCR 南开大学医学院南开大学医学院 lfnn lfnn LogoLogo RT-qPCR 原理原理 Contents 1 RT-qPCR 步骤步骤2 SYBR 实验步骤实验步骤3 LogoLogo RT-qPCR 原理原理 1 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时 监测整个PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通 过通过Ct值和标准曲线的分析对和标准曲线的分析对起始模板进行行定量分析定量分析的方法。 1.荧光原理：S

2、YBR Green 2.定量原理： （1）介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值 （2 2）定量原理：）定量原理： 绝对定量（标准曲线）、相对定量（绝对定量（标准曲线）、相对定量（2 2-Ct -Ct） ） （3 3）融解曲线）融解曲线 非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： 1 1、SYBR GreenSYBR Green 结合于双链结合于双链DNADNA小沟之间，小沟之间，只有和双链只有和双链DNADNA结结 合后才发荧光合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及。（在变性过程中无荧光，在复性及 延伸过程中发出荧光）延伸过程中发出荧光） RT-qPCR 原理原理-荧光原理荧光原理 特异性

3、荧光标记：特异性荧光标记： 1 1、TaqManTaqMan 水解型杂交探针水解型杂交探针。55端标记有报告端标记有报告 基团基团R R，33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 Q Q。探针完整探针完整 ，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被QQ基团吸收基团吸收，无荧光无荧光。 TaqTaq酶有酶有 53 53外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针R R 与与QQ分开，发分开，发出出荧光荧光。 2 2、Molecular BeaconMolecular Beacon 分子信标。分子信标。标记荧光的发夹标记荧光的发夹 探针探针，环与目标序列互补环与目标序列互补，茎由互补

4、配对序列组茎由互补配对序列组 成成。变性过程：产生非特异性荧光变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：延伸过程： 不产生荧光不产生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测退火过程：产生特异性荧光，检测 荧光信号荧光信号。 3 3、AmplisensorAmplisensor 双链信号引物，进行半巢式扩增双链信号引物，进行半巢式扩增 ；随着；随着PCRPCR循环的重复进行，信号引物的双链结构循环的重复进行，信号引物的双链结构 被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光 消失，消失，产物量与荧光成反比产物量与荧光成反比。 Q QQ Q R R LogoLogo

5、RT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理 1 扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（横坐标：扩增循环数（CycleCycle） 纵坐标：荧光强度纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的每个循环进行一次荧光信号的 收集收集 CtCt值的定义：值的定义：PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增过的扩增循环次数循环次数。CtCt值极具重现性。分析定量时多取值极具重现性。分析定量时多取15-3515-35较好。较好。 荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）：）： 前前1515

6、个循环信号作为荧光本底信号（个循环信号作为荧光本底信号（baselinebaseline），即样本的荧光背景值和阴），即样本的荧光背景值和阴 性对照的荧光值性对照的荧光值。荧光域值荧光域值的缺省设置是的缺省设置是3 31515个循环的荧光信号的标准偏个循环的荧光信号的标准偏 差的差的1010倍倍。 LogoLogo RT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理 1 理想的理想的PCRPCR反应：反应： X=XX=X0 0* *2 2n n 非理想的非理想的PCRPCR反应：反应： X=X0 (1+Ex)nX=X0 (1+Ex)n n n： 扩增反应的循环次数扩增反应的循环次数 X X： 第第n

7、n次循环后的产物量次循环后的产物量 X X0 0：初始模板量：初始模板量 ExEx：扩增效率：扩增效率 log log X X0 0= - log(1+Ex) = - log(1+Ex) * *CtCt+ log+ log X X Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即CtCt值值 就可计算出样品中所含的模板量. 1. 1.绝对定量绝对定量 LogoLogo RT-qPCR 原理原理-绝对定量绝对定量 1 q 模板模板DNADNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即量越多，荧光达到域值的循环数越少，即CtCt值越小值越小 q LogLog浓度与循环数呈线性关系，通过已知起

8、始拷贝数的标准品可作出标浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标 准曲线，根据样品准曲线，根据样品CtCt值，就可以计算出样品中所含的模板量值，就可以计算出样品中所含的模板量 1. 1.绝对定量绝对定量 LogoLogo RT-qPCR 原理原理-绝对定量绝对定量 1 R R2 2为相关系数为相关系数：R R2 20.990.99时，认为时，认为 两数值之间相关性好。两数值之间相关性好。 E E为扩增效率为扩增效率：一般认为在：一般认为在90%-90%- 110%110%之间数据可用。之间数据可用。 LogoLogo RT-qPCR 原理原理-相对定量相对定量 1 2.2.相

9、对相对定量定量 结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。 RT-qPCR 原理原理-融解曲线融解曲线 温度 荧光强度 Tm 融融解曲线为解曲线为单一峰单一峰， 无非特异性荧光无非特异性荧光，定定 量准确量准确。 溶解峰反映反应中扩溶解峰反映反应中扩 增到的产物的量。增到的产物的量。 前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。 RT-qPCR 步骤步骤-SYBR Green法法 1. 1.准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连

10、管、移液枪、RealplexRealplex软件软件 2.2.将样本等稍许离心将样本等稍许离心 3.3.加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中） 反应体系：反应体系： ddH2O 10L ddH2O 10L 染料染料 8L 8L 引物上下游各引物上下游各0.5L0.5L 样本样本 1L 1L 4.4.将八连管标记后离心至无壁挂液体将八连管标记后离心至无壁挂液体 5.5.将其置入将其置入RealplexRealplex仪中，仪中， 设置程序：设置程序： 95 15s 95 15s 95 15s 95 15s 57 30s

11、 57 30s 74 30s 74 30s 45 45循环，循环，ENDEND后右键设置后右键设置“insert-melting curve”“insert-melting curve”，后绿色运行，后绿色运行 6 6、反应结束后将数据导出，分析数据。、反应结束后将数据导出，分析数据。 反应体系的建立及优化反应体系的建立及优化: : SYBR Green SYBR Green 使用浓度使用浓度: :太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，荧光信号太弱，不酶活性，太低，荧光信号太弱，不 易检测易检测 PrimerPrimer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgClMgCl2 2（多聚酶的激活剂）（多聚酶的激活剂）浓度浓度: :可以降低到可以降低到1.5mM,1.5mM,以减少非特异性产以减少非特异性产 物物 反应反应BufferBuffer体系的优化体系的优化 反应温度和时间参数反应温度和时间参数: :由酶和引物决定由酶和引物决定 1. 1.其他与常规其他与常规PCRPCR相同相同 RT-qPCR 步骤步骤-SYBR Green法法 q 对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性 -适用于任何适用于任何DNADNA q 使用方便使用方便 -不