细胞免疫检测技术

1、 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。 体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原 或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴 细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞 毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 第二节 淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞淋巴细胞 T T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能） B B细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能） NKNK和和K K

2、细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用） 一、T细胞功能的检测 T T细胞增殖试验细胞增殖试验 T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验 体内试验体内试验 （一）（一）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验 1. 1. 原理：原理： 淋巴细胞淋巴细胞 DNADNA合成合成 分化分化 母细胞母细胞 刺激物刺激物 细胞变大细胞变大 细胞浆扩大细胞浆扩大 空泡空泡 核仁明显核仁明显 核染色质疏松核染色质疏松 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征 转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞 未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞 淋巴母细胞淋巴

3、母细胞 过渡型过渡型 细胞大小细胞大小( (直径直径m)m)12122020121216166 68 8 核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集 核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无 有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无 胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色 浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无 伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无 2. 2. 淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物 非特异性刺激物：非特异性刺激物： PHA -TPHA -T细胞细胞 ConA -TC

4、onA -T细胞细胞 PWM -TPWM -T、 B B细胞细胞 LPS -BLPS -B细胞细胞 特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 3. 3. 检测方法检测方法 形态法：刺激物形态法：刺激物 淋巴细胞（淋巴细胞（4-64-6天）天） 母细胞母细胞 化化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h） DNADNA合成期合成期 + + 3 3HTdRHTdR掺入掺入 收集细胞收集细胞 检测检测射线射线 测定细胞内的测定细胞内的3H3HTdRTdR 方法学评价：方法学评价： 优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，优点

5、：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果， 适于基层实验室应用。适于基层实验室应用。 缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影 响，重复性和准确性较差。响，重复性和准确性较差。 （1 1）形态学检查法）形态学检查法 %100 胞数转化和未转化的淋巴细 转化的淋巴细胞数 转化率 （2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法 优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，掺入法敏感性高，客观性强， 重复性好。重复性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射 性核素污

6、染问题。性核素污染问题。 均值对照孔A 均值试验孔A 570nm 570nm SI ( (二二) T) T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后细胞经各种丝裂原或抗原刺激后, , 分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子, ,可借助免疫学、细胞生物学及分可借助免疫学、细胞生物学及分 子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性 或基因表达水平，以反映或基因表达水平，以反映T T细胞功能。细胞功能。 （三）T细胞介导的细胞毒试验 1.1.原理：原理： 靶细胞抗原靶细胞抗原 T T细胞细胞 观察杀伤活力观察杀伤活

7、力 致敏致敏CTLCTL 靶细胞靶细胞 形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+ +肿瘤细胞肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞 同位素法同位素法 ：淋巴细胞（：淋巴细胞（CTLCTL）+ +含含51Cr 51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 51Cr 释放释放 测定测定射线射线 2.方法 意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 ( (四四) ) 体内试验体内试验 特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验 PHAPHA皮肤试验皮肤试验 二、B细胞功能检测 B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验 溶血空斑试验溶血空斑试

8、验 B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 体内试验体内试验 ( (一一)B)B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验 抗抗IgMIgM 细菌脂多糖细菌脂多糖 SACSAC的的SPASPA B B细胞增殖细胞增殖 形态学形态学 3 3H H TdRTdR掺入法掺入法 ( (二二) ) 溶血空斑试验溶血空斑试验 1. 1. 原理：原理： ( (三三) ) B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法 1.原理：原理： 2应用与方法学评价： 该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗 体分泌量。体分泌量。 优点：优点：

9、 稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检 测组织切片中分泌抗体的单个细胞。测组织切片中分泌抗体的单个细胞。 ( (四四) )体内试验体内试验 体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风 类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免 疫后疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血清，测定受检周分别采血，分离血清，测定受

10、检 者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B B细胞细胞 的功能。的功能。 染色计数染色计数 离心取上清离心取上清 测测LDHLDH或或AKPAKP 离心取沉淀离心取沉淀 测活细胞荧光测活细胞荧光 测发光强度测发光强度 测测CPMCPM值值 形态法形态法 酶释法酶释法 荧光法荧光法 同位素法同位素法 化学发光法化学发光法 三、NK细胞活性测定 靶靶 细细 胞胞 溶溶 解解 常用靶细胞常用靶细胞: : K562细胞株 第三节 吞噬细胞功能检测技术 吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭 作用三个阶段，

11、据此建立相应的检测方法。作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 一、中性粒细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术 一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测 ( (一一) ) 细胞运动功能细胞运动功能趋化功能检趋化功能检 测测 琼脂糖平板法琼脂糖平板法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法） ( (二二) )吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法： 100(%) 计数的白细胞数 吞噬细菌的白细胞数 吞噬率 100(%) 计数的白细胞

12、数 数胞内含着染菌体的细胞 杀菌率 2. 溶菌法 100 min0 min906030 1(%)） 菌落数 菌落数或、作用 （杀菌率 3 3NBTNBT还原试验还原试验 二、巨噬细胞功能检测 ( (一一) )炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，炭粒， 脾巨噬细胞约吞噬清除脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。据此给小鼠定量炭粒。据此给小鼠定量 静脉注射印度墨汁静脉注射印度墨汁( (炭粒悬液炭粒悬液) )，间隔一定时间反，间隔一定时间反 复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中 炭粒被

13、廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。 ( (二二) )吞噬功能检测吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬 功能，常用鸡红细胞功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、酵母、白色念珠菌、酵母 细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬 细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。 ( (三三) )巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定 1 1酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法 2 2非特异性酯酶的

14、测定非特异性酯酶的测定 常用常用-萘醋酸法萘醋酸法 ( (四四) ) 细胞毒作用测定细胞毒作用测定 用用IFN-IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对激活小鼠巨噬细胞，观察其对 125I-UdR125I-UdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀的杀 伤活性。伤活性。 ( (五五) ) 巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血 活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经 3737预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaCl2CaCl2混

15、合液，加入经混合液，加入经 粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置3737，即时，即时 记录血浆凝固时间。记录血浆凝固时间。 反映机体免疫功能状态。反映机体免疫功能状态。 肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。 组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利 于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。 第四节第四节 免疫细胞功能检测的临床应用免疫细胞功能检测的临床应用 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征

16、 转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞 未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞 淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型 细胞大小细胞大小( (直径直径m)m)12122020121216166 68 8 核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集 核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无 有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无 胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色 浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无 伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无 ( (四四) ) 体内试验体内试验 特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验 PHAPHA皮肤试验皮肤试验 ( (三三) ) B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法 1.原理：原理： 一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测 ( (二二) )吞噬功能检测吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬 功能，常用鸡红细胞功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、酵母、白色念珠菌、酵母 细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞等作为吞噬颗粒，用