超氧化物歧化酶SOD活性测定课件

1、超氧化物歧化酶SOD 活性测定 1 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)(SOD) 活性测定活性测定 (NBT(NBT法法) ) 一、测定意义一、测定意义 二、目的要求二、目的要求 三、原理三、原理 四、仪器设备四、仪器设备 五、试剂配制五、试剂配制 六、植物材料六、植物材料 七、操作步骤七、操作步骤 八、结果计算八、结果计算 九、注意事项九、注意事项 十、思考题十、思考题 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 2 一、意义一、意义： 细胞内自由基的产生和消除处于动态平细胞内自由基的产生和消除处于动态平 衡状态，自由基水平很低，不会伤害细衡状态，自由基水平很低，不会伤害细 胞。胞。植物正常情况下植

2、物正常情况下 植物逆境胁迫下植物逆境胁迫下 O O-. -.2 2、 、H H2 2O O2 2、OHOH的产量增加；的产量增加； SODSOD、CATCAT、PODPOD活性降低；活性降低； VtEVtE、VtCVtC、CARCAR、GSHGSH含量降低；含量降低； 从而伤害细胞。从而伤害细胞。 植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 3 什么叫逆境？什么叫逆境？ 逆境逆境是指对植物生存生是指对植物生存生 长不利的各种环境因素的总长不利的各种环境因素的总 称称. . 逆境的种类逆境的种类? ? 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 4

3、为什么要测定为什么要测定 完全液和缺素完全液和缺素 苗的苗的SODSOD活性？活性？ 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 5 二、目的要求：二、目的要求： 1.了解SOD活力测定的实践意义； 2.掌握SOD测定的原理及操作要点； 3.比较完全液溶液和缺素溶液培养的 玉米苗叶片SOD活性的差异。 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 6 三、原理：三、原理： 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 7 三、原理：三、原理： 依据依据SODSOD能抑制氮蓝四唑（能抑制氮蓝四唑（NBTNBT）在光下的还在光下的还 原作用来确定酶活性大小。原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，在有氧化物质存在下， 核黄素可被光还

4、原，被还原的核黄素在有氧条件核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件 下极易再氧化而产生下极易再氧化而产生O O2 2.- .-， ，可将氮蓝四唑还原为蓝可将氮蓝四唑还原为蓝 色的甲腙，后者在色的甲腙，后者在560560nmnm处有最大吸收。处有最大吸收。而而SODSOD可可 清除清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应 后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶 活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 8 四、仪器设备四、仪器设备 研钵；

5、玻璃试管研钵；玻璃试管; 40; 40W W荧光灯荧光灯; ; 移液管等。移液管等。 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 9 五、试剂配制五、试剂配制 1 1、提取介质提取介质5050mmol/L(pH7.0)mmol/L(pH7.0)磷酸缓冲液磷酸缓冲液。 2 2、反应介质反应介质5050mmol/L(pH7.8)mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲液磷酸缓冲液, , 内含内含 77.1277.12mol/Lmol/L硝基四唑蓝硝基四唑蓝, 0.1, 0.1mmol/L EDTA, 13.37mmol/Lmmol/L EDTA, 13.37mmol/L蛋蛋 氨酸。氨酸。 3、80.280.2mol

6、/Lmol/L核黄素溶液核黄素溶液: : 用含有用含有0.10.1mmol/L EDTAmmol/L EDTA的的 5050mmol/L(pH7.8)mmol/L(pH7.8)的磷酸缓冲液配制。的磷酸缓冲液配制。 SODSOD反应混合液反应混合液 3.9ml反应介质反应介质 0.1ml 80.280.2mol/Lmol/L核黄素溶液核黄素溶液 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 10 六、植物材料六、植物材料: : 玉米叶片玉米叶片: 完全液培养苗完全液培养苗 缺素液培养苗缺素液培养苗 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 11 七、操作步骤七、操作步骤 将玉米叶片剪细将玉米叶片剪细 混合均匀混合均匀称

7、称0.0.2g2g ( (用保鲜膜包好放低温用保鲜膜包好放低温 冰箱预冻冰箱预冻) ) 研磨成匀浆研磨成匀浆再加入再加入3 3mlml缓冲液缓冲液,研磨均匀后研磨均匀后, , 将匀浆液倒入聚乙烯离将匀浆液倒入聚乙烯离 心管中心管中低温低温( (0 044) )下、下、48004800rpmrpm离心离心1010minmin上清液即为酶液，上清液即为酶液， 将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供SODSOD活性测定。活性测定。 1、酶液的提取：、酶液的提取： 加入加入2 2mlml冰冷的冰冷的 0.050.05mol/LpH7.0mol/LpH7.0 磷酸缓冲液

8、及少量的磷酸缓冲液及少量的 石英砂石英砂 研钵研钵 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 12 2.2.SODSOD活性测定：活性测定： 取取6 6支试管支试管, , 编号编号, , 按下表加入试剂。按下表加入试剂。将将1 1号管用黑纸袋套上号管用黑纸袋套上, , 与其与其 它试管一起放荧光灯下它试管一起放荧光灯下, , 光强光强30003000LxLx照光照光1010min, min, 到时间后关灯到时间后关灯, , 用黑布用黑布 罩上试管罩上试管( (如室内光线不强如室内光线不强, , 不罩黑布也可不罩黑布也可), ), 以以1 1号试管溶液为参比号试管溶液为参比, , 测测 定样品在定样品在5

9、60560nmnm处的吸光度。处的吸光度。 不加酶的不加酶的2 2号试管溶液颜色最深号试管溶液颜色最深; ; 加入酶的加入酶的 由于由于SODSOD抑制了硝基四唑蓝的光还原抑制了硝基四唑蓝的光还原, ,颜色变浅。颜色变浅。 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 13 2、活性测定： 取6支干燥的、玻璃质量一致的普通试管，按下表顺序加入试剂 试管编号试管编号 123456 参比对照管 正常叶片正常叶片缺素叶片缺素叶片 酶液 100l100l100l100l 提取介质 (磷酸缓冲液) 100l100l SOD反应混合液 (含核黄素含核黄素) 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 各管要充 分摇

10、均匀 放暗处放暗处 置于光强置于光强3000Lx3000Lx照光照光10min10min 560nm 吸光值吸光值 ？ 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 14 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 15 式中：式中：A Ack ck为 为2 2号对照管溶液在号对照管溶液在560560nmnm处的吸光度值处的吸光度值; ; A AE E为样品测定管溶液在为样品测定管溶液在560560nmnm处的吸光值处的吸光值; ; V V为酶液总体积（为酶液总体积（ml)ml)； W W为提取酶液的植物材料的鲜重（为提取酶液的植物材料的鲜重（g)g)； VtVt为测定时酶液的用量为测定时酶液的用量( (ml)ml)。

11、 八、结果计算：八、结果计算： （Ack-AE)V SOD活性活性(U/g鲜重鲜重) AckWVt50 一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半(50(50 ) )时所需的酶量。时所需的酶量。 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 16 九、注意事项九、注意事项: 1.1.所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。 2. 2.照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。 3. 3.要多做对照消除日光灯管的光质差异。要多做对照消除日光灯管的光

12、质差异。 4. 植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时 可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。 5.5.结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 17 十、思考题十、思考题: : 1.1.在在SODSOD活性测定中为什么设照光和暗活性测定中为什么设照光和暗 中两个对照管。中两个对照管。 2. 2.影响本实验准确性的主要因素是什影响本实验准确性的主要因素是什 么？应如何克服？么？应如何克服？ 超氧化物歧化酶 SOD活性测定 18 1.1.下次实验：下次实验：改良半叶法测定植物光合速率改良半叶法测定植物光合速率 2. 请按请按植物生理生化实验植物生理生化实验B