细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项实验员

1、科学、公正、精准科学、公正、精准 *细菌分离鉴定实验的意义细菌分离鉴定实验的意义 * *建立无菌概念，了解无菌操作建立无菌概念，了解无菌操作 * *常规病原菌的分离流程常规病原菌的分离流程 * *病原菌分离鉴定实验原理病原菌分离鉴定实验原理 * *细菌对药物的敏感性试验细菌对药物的敏感性试验 * *细菌学实验操作注意事项细菌学实验操作注意事项 1 2 3 科学、公正、精准科学、公正、精准 意义意义 细菌分离鉴定实验 超级耐药菌超级耐药菌健康养殖健康养殖 确诊疾病确诊疾病 诊疗方案诊疗方案 科学、公正、精准科学、公正、精准 建立无菌观念建立无菌观念 什么是无菌什么是无菌 无菌，指没有活菌的意思，

2、又是生物技术中的一个重要概念。只有在无菌，指没有活菌的意思，又是生物技术中的一个重要概念。只有在 培养基、发酵设备等处于无菌的前提下，微生物接种后，才能实现纯培养基、发酵设备等处于无菌的前提下，微生物接种后，才能实现纯 种培养，最终得到所需的产品。种培养，最终得到所需的产品。 科学、公正、精准科学、公正、精准 科学、公正、精准科学、公正、精准 接种方法 曲线划线法、分区划线法 倾注法、涂布法（细菌计数） 斜面接种法（生化鉴定、保存菌种） 穿刺培养法（生化鉴定、保存菌种） 液体培养基接种法 科学、公正、精准科学、公正、精准 科学、公正、精准科学、公正、精准 科学、公正、精准科学、公正、精准 病原

3、菌的分离鉴定病原菌的分离鉴定 细菌分离培养细菌分离培养 主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对某一种主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对某一种 细菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌细菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌 落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定。 科学、公正、精准科学、公正、精准 1.1.基本条件基本条件 （1 1）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯 （2 2）培养箱：普通恒温培养箱）培养箱：普通恒温培养箱 （3 3）无菌室

4、和超净工作台）无菌室和超净工作台 （4 4）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、SSSS琼脂琼脂 2.2.接种方法接种方法 分区划线法分区划线法 用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三 区依次用接种环划线。区依次用接种环划线。 每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一 区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线2 23 3次，使菌量逐渐减次，使菌量逐渐减 少，以形成单个菌落。少，

5、以形成单个菌落。 划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。 科学、公正、精准科学、公正、精准 （2 2）液体培养基接种法（增菌法）液体培养基接种法（增菌法） 用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界处轻轻研磨用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界处轻轻研磨 ，使菌团混匀在液体培养基中。，使菌团混匀在液体培养基中。 （3 3）倾注平板法）倾注平板法 主要用于水质（饮水）的细菌计数主要用于水质（饮水）的细菌计数 将灭菌生理盐水适量稀释（通常做将灭菌生理盐水适量稀释（通常做1010-1 -1-10 -10-4 -4稀释）的

6、水质 稀释）的水质1ml1ml，置灭，置灭 菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至5050左右的培养基左右的培养基15ml15ml，混匀，混匀， 待冷却后，倒置。于待冷却后，倒置。于3737恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数 ，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。 科学、公正、精准科学、公正、精准 大肠杆菌细菌分离大肠杆菌细菌分离 黑色带有金属光泽，圆形隆起黑色带有金属光泽，圆形隆起粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、 边缘整齐；边缘整齐

7、； 科学、公正、精准科学、公正、精准 沙门氏菌细菌分离沙门氏菌细菌分离 圆形、微凸、边缘整齐、直径在圆形、微凸、边缘整齐、直径在 12 mm的小菌落，菌落无色透明、的小菌落，菌落无色透明、 淡黄色透明或外周透明中心黑色淡黄色透明或外周透明中心黑色 蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌 株菌落中心带黑色株菌落中心带黑色 科学、公正、精准科学、公正、精准 实验室分离实验室分离 链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、 圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落 巴氏杆菌在血琼脂平板生长为巴氏杆菌在血琼脂平板生长为 淡灰白色，闪光的露

8、珠状小菌淡灰白色，闪光的露珠状小菌 落落 科学、公正、精准科学、公正、精准 形态学检查形态学检查 染色标本的检查染色标本的检查 通过对标本的涂片及染色观察细菌的形态、大小、排列、染色特性，通过对标本的涂片及染色观察细菌的形态、大小、排列、染色特性， 一及荚膜、鞭毛、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或一及荚膜、鞭毛、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或 诊断。诊断。 1.涂片：从肉汤或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理盐水的玻涂片：从肉汤或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理盐水的玻 片上，涂片厚薄适当。片上，涂片厚薄适当。 2.固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过固定：涂片干

9、燥后，在火焰上迅速通过3次，加热固定。次，加热固定。 3.染色：滴加染液覆盖菌膜。染色：滴加染液覆盖菌膜。 4.脱色：乙醇是最常用的脱色剂，脱色：乙醇是最常用的脱色剂，70%乙醇和无机酸脱色能力强。乙醇和无机酸脱色能力强。 5.复染：复染可使脱色的细菌重新着色。复染：复染可使脱色的细菌重新着色。 科学、公正、精准科学、公正、精准 常用的染色方法常用的染色方法 革兰氏染色法：最常用的一种染色方法革兰氏染色法：最常用的一种染色方法 （1）染色步骤）染色步骤 结晶紫初染：结晶紫染色结晶紫初染：结晶紫染色1.5min，水洗，甩干，水洗，甩干 碘液媒染：碘液染色碘液媒染：碘液染色2min，水洗，甩干，水

10、洗，甩干 酒精脱色：酒精脱色：95%乙醇脱色，乙醇脱色，2030s，脱色到无结晶紫为止，水洗，脱色到无结晶紫为止，水洗 ，甩干，甩干 石碳酸复红复染：石碳酸复红染色石碳酸复红复染：石碳酸复红染色1.5min ，水洗，吸水纸吸干。，水洗，吸水纸吸干。 （2）结果）结果 革兰氏阳性蓝紫色，革兰氏阴性紫红色。革兰氏阳性蓝紫色，革兰氏阴性紫红色。 科学、公正、精准科学、公正、精准 大肠杆菌形态鉴定大肠杆菌形态鉴定 科学、公正、精准科学、公正、精准 沙门氏菌形态鉴定沙门氏菌形态鉴定 科学、公正、精准科学、公正、精准 巴氏杆菌形态鉴定巴氏杆菌形态鉴定 科学、公正、精准科学、公正、精准 链球菌形态鉴定链球菌

11、形态鉴定 科学、公正、精准科学、公正、精准 葡萄球菌形态鉴定葡萄球菌形态鉴定 科学、公正、精准科学、公正、精准 病原菌的生化鉴定病原菌的生化鉴定 糖类发酵试验糖类发酵试验 原理：不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖能力不同，产生代谢物原理：不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖能力不同，产生代谢物 不同，看细菌是否分解各类糖，是否产酸产气。不同，看细菌是否分解各类糖，是否产酸产气。 葡萄糖代谢类型鉴别试验葡萄糖代谢类型鉴别试验 原理：又称氧化原理：又称氧化/ /发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧 （氧化性），还是无氧酵解（发酵型），或

12、不分解葡萄糖（产碱性）（氧化性），还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱性） 三糖铁试验三糖铁试验 原理：三糖铁用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可原理：三糖铁用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可 初步鉴定细菌的菌属。初步鉴定细菌的菌属。 科学、公正、精准科学、公正、精准 生化鉴定生化鉴定 科学、公正、精准科学、公正、精准 细菌对药物的敏感性试验细菌对药物的敏感性试验 抗菌药物敏感性试验（抗菌药物敏感性试验（ASTAST，药敏试验），药敏试验） 用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用 。常用最低抑菌浓度（。

13、常用最低抑菌浓度（MICMIC）表示，即体外能够抑制）表示，即体外能够抑制 细菌生长的最低药物浓度。细菌生长的最低药物浓度。 方法：方法： 扩散法（纸片法）扩散法（纸片法） 稀释法（琼脂稀释法和液体稀释法）稀释法（琼脂稀释法和液体稀释法） 科学、公正、精准科学、公正、精准 快速药敏试验：快速药敏试验： 由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行（16-24h16-24h），），可可 根据药敏结果初步进行治疗。根据药敏结果初步进行治疗。 前增菌法药敏试验：前增菌法药敏试验： 挑取组织培养后菌落，放于灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实挑取组织培养后菌落，放于

14、灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实 验验8-12h8-12h后观察结果。后观察结果。 传统法药敏试验：传统法药敏试验： 耗时较长（耗时较长（2-32-3天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性 时，可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后时，可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后 ，进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的，进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的 敏感性。敏感性。 试验方法试验方法 科学、公正、精准科学、公正、精准 （1 1）样品处理：）样品处理： 用灭菌棉签沾取组织内

15、部，然后打开装有增菌液（营养肉汤）用灭菌棉签沾取组织内部，然后打开装有增菌液（营养肉汤） 的管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒的管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒 温箱中温箱中3737培养培养12-2412-24小时，此肉汤菌液为前增菌液。小时，此肉汤菌液为前增菌液。 （2 2）细菌分离培养：）细菌分离培养： 待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的 细菌变混浊。若变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于细菌变混浊。若变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于 麦康凯琼脂、麦康

16、凯琼脂、SSSS琼脂，琼脂，3737培养培养12-24h12-24h，观察是否有细菌生长，初，观察是否有细菌生长，初 步判定感染病原菌的类型。步判定感染病原菌的类型。 操作过程操作过程 前增菌药敏试验前增菌药敏试验 科学、公正、精准科学、公正、精准 （3 3）涂板、贴纸片：）涂板、贴纸片： 用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤掉多余水用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤掉多余水 分，均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转分，均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转6060度，度， 最后沿周边绕两圈，保证涂均匀，并贴上药敏纸片，最后沿周边绕两圈，保证涂均

17、匀，并贴上药敏纸片，3737倒置培养倒置培养 8 8 - 18h- 18h，观察结果。，观察结果。 操作过程操作过程 科学、公正、精准科学、公正、精准 （4 4） 结果观察、判定标准结果观察、判定标准 抑菌圈：用抑菌圈：用游标卡尺游标卡尺从平板背面精确测量各个抑菌圈直径（精确到从平板背面精确测量各个抑菌圈直径（精确到 0.01mm0.01mm），抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。原料药判定），抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。原料药判定 按按抗微生物药物敏感性试验执行标准抗微生物药物敏感性试验执行标准20102010 成品药判定标准成品药判定标准 ： 20 mm 20 mm 极

18、敏极敏 15-20 mm 15-20 mm 高敏高敏 10-14 mm 10-14 mm 中敏中敏 10 mm 10 mm 不敏不敏 选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用 过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生 科学、公正、精准科学、公正、精准 科学、公正、精准科学、公正、精准 科学、公正、精准科学、公正、精准 细菌学实验操作注意事项细菌学实验操作注意事项 1 1、无菌观念要加强，双重保护很重要。、无菌观念要加强，双重保护很重要。 2 2、发病前期好时机，最好三两混合取。、发病前期好时机，最好三两混合取。 3 3、细

19、菌分离常练习，分离手法越熟练。、细菌分离常练习，分离手法越熟练。 4 4、染色三不过、染色三不过 涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。 5 5、药敏实验方法多，选取最佳很重要。、药敏实验方法多，选取最佳很重要。 科学、公正、精准科学、公正、精准 科学、公正、精准科学、公正、精准 实验室分离实验室分离 链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、 圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落 巴氏杆菌在血琼脂平板生长为巴氏杆菌在血琼脂平板生长为 淡灰白色，闪光的露珠状小菌淡灰白色，闪光的露珠状小菌 落落 科学、公正、精准科学、公正、精准 实验室分离实验室分离 链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、 圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落 巴氏杆菌在血琼脂平板生长为巴氏杆菌在血琼脂平板生长为 淡灰白色，闪光的露珠状小菌淡灰白色，闪光的露珠状小菌 落落 科学、公正、精准科学、公正、精准 大肠杆菌形态鉴定大肠杆菌形态鉴定 科学、公正、精准科学、公