稀土荧光探针检测多巴胺及类似物.

1、稀土荧光探针检测稀土荧光探针检测 多巴胺及类似物多巴胺及类似物 答辩人：袁洁 导师：赵美萍 副教授 2003年6月18日 n选题背景 n已有检测方法综述 n实验部分 n总结 n致谢 儿茶酚胺的结构 及生理意义 n儿茶酚胺（catecholamine, CA） 的种类、结构和生理意义 n神经递质在单细胞检测中的意义 Dopamine（DA） n瑞典神经药理学家Carlsson于1958 年首次提出脑内多巴胺(DA)是独立的 神经递质 n正常值范围为血浆：888pmol/L； 尿：424-2612nmo1/24h。 n增高会引起嗜铬细胞瘤，心肌梗塞， 糖尿病酮症酸中毒等一系列疾病。 而其含量的降低

2、会引起植物神经病 变，帕金森病等。 Epinephrine（E）& nor epinephrine （NE） 在人体内的正常值 范围为 血浆：480pmo1/L； 尿：0-80nmo1/24h l在人体内的正常值范 围为血浆：615- 3240pmol/L； 尿： 0-590 nmol/24h 对儿茶酚胺的检测手段对儿茶酚胺的检测手段 检测方法灵敏度优点缺点 放射酶学法放射酶学法 2.210 -1 0 M , 灵敏度高 ，选择性 好 技术难度高 ，检测速 度慢，危险 HPLC法法 depends 分离效果好 ，可结 合不同检测器应用 流动相有可能影响检测 效果 荧光测定法荧光测定法 (THI(

3、THI、EDA) EDA) 10 10M-10 9 M（改良后） 常规使用，改良后 灵敏度较高 样品处理程序复杂，特 异性不高 电化学分析电化学分析 法法 10 6M-10 5 M 能排除抗坏血酸的 影响，重现性较好 灵敏度低,只是针对DA 检测,仍处于实验研究 阶段 毛细管电泳毛细管电泳 （CE）法）法 10-8 M （depends） 分离高效,耗样量少 灵敏度尚不高 稀土荧光探稀土荧光探 针法针法 10-8 M简便，可以与各种 分离手段联用 灵敏度不够高 稀土荧光探针检测稀土荧光探针检测 儿茶酚类化合物的原理儿茶酚类化合物的原理 单纯的TbCl3，Tb-DCTA体系和DOPAC 在实验用

4、的波长条件下(298nm,546.8nm) 都没有荧光信号，可见体系发光是由于 形成了Tb-DCTADOPAC三重络合物并 发生了能量转移得结果。 DOPAC的荧光图的荧光图 红：激发波长为279nm 蓝：激发波长为298nm TbCl3的荧光图的荧光图 红：激发波长为298nm 蓝：激发波长为240nm TbDCTA荧光图荧光图 玫红：激发波长为240nm 绿：激发波长为240nm（三 重络合物，TbDCTA浓度 同上） 绿：激发波长为298nm TbDCTADOPAC 体系荧光图体系荧光图 绿：激发波长为240nm 红：激发波长为279nm 蓝：激发波长为298nm 1.三元络合物的形成三

5、元络合物的形成 三元络合物体系：三元络合物体系： 1.离子缔合三元络合物 2.金属离子先后结合两种配体形成三元络合 物 TbDCTACAs体系：体系： Tb与DCTA先行络合，然后Tb余下的空位再 与CAs络合，形成三重络合体系 2.三元络合物发光机理三元络合物发光机理(1) 配体受激后,单重态（S1）有三种方式退激： a. 产生荧光的辐射跃迁(S1-S0) b. 系间窜跃(S1-T1) c. 无辐射跃迁回基态(ISC) 三重态（T 1）也有三种退激方式： a. 产生磷光的辐射跃迁(T1-S0) b. 通过无辐射转移跃迁到Tb3的激发态(ET)， c. 无辐射跃迁回基态(T1S0)。 2.三元

6、络合物发光机理三元络合物发光机理(2) 分子内能量转换效率的影响因素： 1.配体最低的激发三重态（T1）能量高于Tb的 5D4能级的能量 2.能量转移的速率大于三重态无辐射退激的速率 3.从配体激发单重态向三重态系间窜跃的速率和 几率相当高 2.三元络合物发光机理三元络合物发光机理(3) 儿茶酚胺的磷光发射波长在409 nm 417 nm，亦即其三重态（T1）的能量高 于Tb3的5D 4能级约3800-4000 cm 1 高量子产率和跃迁几率 能量转移速率常数高达1010s1 由水或解离的氧导致的配体三重态（T1） 以及Tb3， 发光的猝灭也大大减少了。 实验条件的优化实验条件的优化 稀土离子

7、与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 1. Eu3 + EDTA体系 ； 2. Eu3phen体系； 小结： 最终弃用这两个体系的原因，是其适用 的pH范围太低，难以使DA的羟基充分解 离形成三元络合物。 实验条件的优化实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 3. Tb3 + EDTA体系（1）： Tb:EDTA1:1（浓度均为2 mmol/L）, pH11, ex300 nm，em545 nm,加入甲醇 （分析纯）、CsCl、TOPO等尝试敏化,无法得到满意 检测限，DA为105 mol/L 小结： 目前研究最多的体系，适用的pH相对于前两个体系有 了很

8、大提高，但是仍然未能达到文献报道的结果 实验条件的优化实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 3. Tb3 + EDTA体系（2）： Tb:EDTA1:1（浓度均为2 mmol/L）, pH11, ex240 nm，em545 nm,出现递减结果 小结： 在ex240 nm，em545 nm,出现的Tb3特征波长 处的递减结果，可能是由于在检测条件下,TbEDTA 体系能发出Tb3的特征荧光，而待测物与之形成三重 络合体系后,激发波长红移，亦即三重络合体系的形成 导致了一部分Tb3特征荧光的猝灭。 0.000000.000050.000100.000150.000

9、20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Fluor CDA/M 0.000000.000050.000100.000150.00020 40 60 80 100 120 140 160 180 Fluor CDOPAC/M ACDOPACFluro图 BCDA-Fluro图 实验条件的优化实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 4. Tb3 + DCTA体系 ： 20C 时， Tb3与EDTA的络合常数lgK1 为17.93，而与DCTA的络合常数lgK1为 20.20* 因此本体系可以在更高pH下存在，更利 于三重络合物形成 p

10、H影响 11.011.512.012.513.0 41 42 43 44 45 46 47 48 Fluor pH 20304050607080 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 Fluor VNaOH/ul 0.4 mmol/L Tb3 DCTA，2105 mol/L DOPAC，横 坐标为pH 0.2 mmol/L Tb3DCTA， 4105 mol/L DOPAC溶液 （色谱纯甲醇：重蒸水9： 1），横坐标为5 ml样品中10 mol/L NaOH的体积 表面活性剂的影响 由于水分子对荧光有相当的猝灭作用，体系又 是在水相中，因此尝试加入表面

11、活性剂进行改 进。期望荧光体系能够被包裹在表面活性剂形 成的胶束中得到保护，起到敏化作用。 共尝试加入了阴离子表面活性剂十二烷基磺酸 钠，阳离子表面活性剂溴代十二烷基三甲胺和 非离子表面活性剂TOPO。都未起到期望的对 体系的改善作用。 甲醇含量影响 0.2 mmol/L Tb3DCTA， 4105 mol/L DOPAC溶 液 ，NaOH fixed 020406080100 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Fluro 甲 醇含量 （） 重原子影响 重原子对于荧光体系 有时也可起到敏化作 用。实验尝试向体系 加入了SrCl2，BaCl2， 以及CsC

12、l，其中CsCl 的加入对体系的荧光 有明显得增强作用 ， 最后选择CsCl浓度为 0.1 mol/L。 0.000.020.040.060.080.10 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 Fluro CCS+/M 加样顺序影响 TbDCTA， 甲醇， NaOH， CsCl TbDCTA， 甲醇， CsCl， NaOH TbDCTA， NaOH，甲醇， CsCl TbDCTA， NaOH， CsCl，甲醇 Tb，DCTA， 甲醇， NaOH， CsCl DCTA， 甲醇， Tb，NaOH， CsCl 实验操作 向5 ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA

13、溶液0.1 ml、10mo l/L NaOH溶液0.04 ml、10 mol/L CsCl溶液0.05 ml、色谱纯 甲醇4.5 ml，混匀。在检测前再加入待测 物，用重蒸水定容至5 ml，在激发波长 为298 nm，发射波长546.8 nm处用0.5 cm比色池测定荧光强度。 实验结果 a. CDA Fluro图 b. CDOPAC- Fluro图 0.0000000.0000020.0000040.0000060.000008 0 50 100 150 200 250 Fluro CDA/mol L -1 B Data1B 0.0000000.0000020.0000040.0000060

14、.000008 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Fluro CDOPAC/mol L -1 B Data1B 实验结果 c. C邻二酚 Fluro图 d. C3，4二羟基苯甲酸Fluro图 0.0000000.0000020.0000040.0000060.000008 0 50 100 150 200 250 Fluro CCA/mol L 1 B Data1B 0.0000000.0000020.0000040.0000060.000008 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Fluro C3,4-二羟 基苯 甲 酸/mol L -1 B Linear Fit of Data1_B 实验结果 被测物 指标 多巴胺 （DA） 3,4二羟 基苯乙酸 （DOPAC） 邻二酚 （儿茶酚） 3,4二 羟基苯甲 酸 线性范围 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 810 6mol/L 线性相关 系数 0.99880.99920.99670.9982 检测限5.210 8 mol/L 3.610 8 mol/L 5.710 8 mol/L 2.9710 8 mol/L 1.证明了CAs