荧光分析法的应用

1、 荧光光谱法研究亚甲蓝与三种荧光光谱法研究亚甲蓝与三种 芳香族氨基酸的相互作用芳香族氨基酸的相互作用 荧光分析法荧光分析法测定肉类食品中诺氟测定肉类食品中诺氟 沙星的残留沙星的残留 荧光光谱法研究亚甲蓝与三种荧光光谱法研究亚甲蓝与三种 芳香族氨基酸的相互作用芳香族氨基酸的相互作用 前言前言： 亚甲蓝(Methylene blue，简称MB)，即3，7-双(二甲氨基)吩 噻嗪-5-翁氯化物，是一种常见的吩噻嗪类药物，其与蛋白质具有 很好的亲和力，可以改变药物在生物体内的分配和代谢。其可用 作癌症光化学治疗剂、起到协同抗肿瘤作用，以及肿瘤染色标记 等；另外，亚甲蓝对细胞具有明显的解毒功效，在镇痛、

2、抗菌、 抗病毒等方面也有明确的治疗作用。因此研究亚甲蓝的药理作用 是十分有意义的工作。 色氨酸(Tryptophan，简称Trp)、酪氨酸(Tyrosine，简称Tyr)及 苯丙氨酸(Phenylalanine，简称Phe)是三种芳香族氨基酸，是构成 蛋白质和多肽的主要物质，是生物体中不可缺少的营养成分之 一。这三种氨基酸具有荧光，也是蛋白质天然荧光的主要来源， 其具有广泛的用途。 开展药物与氨基酸的相互作用研究，有助于深入了解药物作 用机制及在体内运输、代谢过程，而且对于新型药物的设计具有 重要的指导作用。 溶液配制： 配制浓度为210-4mol/L 的MB储备液；Trp、Tyr和Phe储备

3、液 的浓度分别为210-4mol/L、210-4mol/L 和210-3mol/L (210-3mol/L、210-3mol/L 和210-2mol/L )；配制0.02mol/L 的pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液(含0.1mol/L 的NaCl以恒定的溶液离 子强度)。光谱测定所需溶液均使用缓冲溶液稀释、定容。 荧光光谱测定： 分别恒定温度在298.15K和310.15K条件下，按实验需要，准确 移取一定量的MB和各氨基酸标准溶液于10mL容量瓶，用 pH7.4的Tris-HCI缓冲溶液定容，水浴恒温振荡1h，然后冷却 至室温，置于1cm的石英比色皿中，设置荧光光谱仪的激发和 发射光

4、栅狭缝均为5nm，光电倍增管电压为700mV，扫描速度 为300nmmin-1，在此条件下记录280nm550nm范围内的荧光 光谱。 结果与讨论 一、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的荧光猝灭光谱一、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的荧光猝灭光谱 分别固定Trp、Tyr和Phe浓度，依次递增MB浓度，设置Trp、 Tyr和Phe激发波长为277nm、273nm和260nm，在相同实验条 件下，分别测定298.15K和310.15K时MB与Trp、MB与Tyr以及 MB与Phe相互作用荧光光谱。 由图可见，Trp、Tyr和Phe的最大荧光发射波长分别为346、 303nm和282nm，随着MB浓度递增，Trp

5、、Tyr和Phe荧光强度均逐渐 降低，荧光光谱峰形保持不变，MB-Trp最大吸收位置红移约3nm， MB-Tyr红移约5nm，MB-Phe荧光峰蓝移约3nm。以上实验结果说明 MB与Trp、MB与Tyr以及MB与Phe发生相互作用导致Trp、Tyr和Phe 发生了荧光猝灭现象。 插图为荧光猝灭值(F0-F)对cMB(210-62.310-5mol/L )的线性 拟合曲线，其中F0和F分别表示不加入和加入MB的荧光强度。相应 回归方程的相关系数均在0.99以上，呈现很好的线性相关性，表明该 法可用于痕量MB的测定。 二、亚甲蓝对三种芳香族氨基酸的荧光猝灭机理二、亚甲蓝对三种芳香族氨基酸的荧光猝灭

6、机理 荧光猝灭是溶液中猝灭体分子和荧光物质分子之间发生 相互作用，使荧光物质的荧光量子效率降低或激发态寿命缩 短，从而导致荧光强度降低的现象。荧光强度降低分为：动 态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是指猝灭剂与荧光物质的激发 态分子之间所发生的与扩散有关的相互作用过程；静态猝灭 是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物，从 而导致荧光强度降低的过程。 MB对三种氨基酸发生的荧光猝灭，其应遵循Stem- Volmer方程： F0/F-1=Ksvc=Kq0c (1) 式中，F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂的荧光强度； c为猝灭剂浓度，Ksv为动态Stern-Volmer猝灭常数，Kq是由扩 散过

7、程控制的双分子动态猝灭速率常数，0为没有猝灭剂存 在下荧光分子平均寿命。 根据式(1)绘制三种氨基酸分别在298.15K和310.15K下的( F0/F-1)C的线性拟合曲线(如图4所示)。 结果显示，MB-Trp、MB-Tyr和MB-Phe作用过程中，随 着温度升高Ksv减小，说明升高温度可能降低了复合物的稳 定性，从而使猝灭常数下降。由此推断MB对Trp、Tyr和Phe 均为静态猝灭作用。 Trp、Tyr和Phe的荧光寿命分别为3.110-9s、3.610-9s 和6.810-9s。根据式(1)，由Ksv值计算得到Kq值及各线性回 归方程相关系数R1 ，结果列于表1。表明，MB与上述三种

8、氨基酸的线性拟合程度较好，且得到的Kq值均在1013数量级 以上，远大于各种猝灭体对生物大分子的最大扩散猝灭常 数21010Lmol-1s-1，由此推断其荧光猝灭机制是由于MB 与三种芳香族氨基酸均形成基态复合物而导致的静态猝灭 过程，而非由扩散过程控制的动态猝灭过程 。 三、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的表观结合常三、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的表观结合常 数数Kc与结合位点数与结合位点数n 小分子间结合的表观结合常数Kc和结合位点数n可由式 (2)求出： lg(F0-F)/F=lgKc+nlgc (2) 在298.15K和310.15K下分别作MB与三种氨基酸作用的 lg(F0-F)/Flgc的

9、双对数图，如图5所示。 由图5线性拟合的截距和斜率，分别获得两温度下的Kc、n 和线性回归系数R2，结果见表2： 得出以下结论：(1)MB与三种芳香族氨基酸的摩尔结合 比n接近1：1，表明MB分子与氨基酸分子体积较为接近，一 分子亚甲蓝基本是与一分子氨基酸结合；(2)相应的结合平衡 常数Kc值的数量级均在105以上，表明MB与Trp、Tyr和Phe之 间有较强的结合作用。 四、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸相互作用力类四、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸相互作用力类 型的确定型的确定 药物和生物分子之间的相互作用力主要包括氢键、范 德华力、静电作用和疏水作用等。本文在298.15K和 310.15K下，基于

10、范特霍夫方程计算相应的热力学参数 ， 研究MB与三种芳香族氨基酸之间的相互作用力。由于 rHm随温度变化很小，故将 rHm近似为常数，由式(3) 式(5)计算MB与三种芳香族氨基酸结合的热力学参数 rHm，rGm 和rSm ，结果列于表3。 由表3可看出：(I)MB-Trp反应过程中 rHm0，为吸热反应 ，升高温度有利于复合物的生成，所以升高温度使结合常数增 大，复合物稳定性增强；(2)MB-Tyr和MB-Phe反应过程的 rHm 0，反应为放热反应，升高温度将不利于向着生成复合物的方 向进行，故结合常数减小，生成复合物稳定性下降；(3)MB与 三种芳香族氨基酸结合的 rGm0，表明结合过程

11、均是自发分 子作用过程；(4)根据药物分子与生物大分子作用的有关热力学 参数可以简单判定其相互作用类型。在MB-Trp作用过程中， rGm0，rSm 0，从热力学角度看，MB主要通过疏 水作用与Trp发生结合反应；在MB-Tyr和MB-Phe结合过程中， rGm 0， rHm0，表明它们之间的相互作用主要 是静电作用力。 结论 1、MB与三种芳香族氨基酸因形成基态复合物而产生 静态猝灭。 2、MB与各氨基酸结合摩尔比为1：1且相互之间作用 力较强。 3、MB与三种氨基酸之间是自发作用过程，其中MB- Trp之间主要靠疏水作用力结合，而MB-Tyr和MB-Phe 结合过程以静电作用力为主。 Ch

12、emical Research and Application 文章编号：1004-1656(2015)06-0815-07 荧光分析法测定肉类食品中诺氟荧光分析法测定肉类食品中诺氟 沙星的残留沙星的残留 前言前言： 诺氟沙星(Norfloxacin，NFLX)又名氟哌酸，为第三代喹诺酮 类抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强，毒副作用低和临床疗 效高的特点，是临床应用最广泛的喹诺酮类药物之一。诺氟沙星 系化学合成药物，合成容易，价格低廉，故也是动物和水产养殖 中最重要的抗感染药物之一，然而由于滥用现象严重，导致药物 残留，给食品安全带来严重的威胁。该类药物的残留除其本身的 毒副作用对人体造成直

13、接危害外，更为严重的是人类长期食用含 较低浓度药物的动物源性食品，容易诱导人类致病菌产生耐药性 ，从而影响该类药物的临床疗效。 样品前处理方法： 取2 g经绞碎的各种肉类食品，每次加入10mL pH=4的盐 酸溶液超声提取三次，每次10min，各离心10 min(3000 r/min)，合并三次上清液，加入1mL的Al3+标准溶液，定容至 50mL，待测。 测定方法： 于5 mI 的具塞刻度试管中配制NFLX -Al3+的最佳体系溶 液，使体系溶液中Al3+浓度为2.0mmolL-1 、pH=4.0，静置5 min，取试液置于1 cm1 cm石英液池中，设置激发和发射 单色仪狭缝宽度均为5 n

14、m，扫描速度为1200 nmmin-1，利用 荧光分析法测定。 结果与讨论 一、金属离子的选择一、金属离子的选择 许多金属离子可与诺氟沙星发生络合反应，使荧 光强度发生变化。实验考察了Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+ 、Zn2+、Cu2+和Ni2+等七种不同金属离子与诺氟沙星配 位反应后荧光强度的变化，结果发现Al3+、Fe2+、Mg2+ 和Zn2+与诺氟沙星配位后荧光强度增强，增强的顺序 为Al3+ Zn2+Fe2+Mg2+；而Fe3+、Cu2+和Ni2+使诺氟 沙星的荧光强度受到猝灭。因此，我们选择Al3+增强诺 氟沙星的荧光强度作为分析测定的条件，其荧光光谱 变化如图1。 二、稳定

15、性实验二、稳定性实验 实验考察了NFLX-Al3+反应体系在24 h内荧光强度的变 化情况。结果可得从05 min之内，体系的荧光强度呈递 增状态，从5 min到24 h之间，荧光强度的变化在3%以内 ，因此实验选择NFLX-Al3+体系反应5 min后进行分析测定 。 三、三、pH值的影响值的影响 诺氟沙星结构中的氧原子 和氮原子在不同酸碱溶液中的 质子化程度不同，从而影响发 光体系的电子性质以及电子云 分布，最后使NFLX-Al3+体系的 荧光性质和强度发生变化。实 验考察了在不同pH值溶液中荧 光强度的变化，结果如图2所示 ，当溶液的pH=4时，NFLX- AI3+体系的荧光强度最大。

16、四、四、Al3+浓度的影响浓度的影响 实验选择诺氟沙星与不同Al3+浓度进行反应，测量其荧 光强度的变化，结果可得当Al3+浓度达到2.0 mmolL-1时体系 的荧光强度最大且处于稳定，见图3。故实验选择Al3+浓度为 2.0mmolL-1作为反应的浓度。 五、样品背景干扰情况五、样品背景干扰情况 肉类样品的基体复杂，实验考察了各种肉类样品基体 的干扰情况，从实验结果可得空白肉类基体主要是内源性 蛋白质的干扰，即内源性蛋白质有着较强的荧光强度，但 在本实验选取的最佳条件下荧光峰位置 em=433 nm处测定 时，内源性蛋白质的荧光强度可以忽略不计，见图4。 六、标准工作曲线和检出限六、标准工作曲线和检出限 梯度配制不同浓度的诺氟沙星标准溶液，在最佳实验条 件下，荧光法分别测定每一种溶液的荧光强度，以em=433 nm处的荧光强度对诺氟沙星的浓度作工作曲线，见图5。得 诺氟沙星的线性方程为F=15.89+36.50C，线性范围为0.5 250 ngmL-1，相关系数R=0.9999，方法的检出限为0.032 ngmL-1。 七、精密度实验七、精密度实验 配制6份相同质量浓度为10 ngmL-1的诺氟沙星溶液，在 一定的实验条件下进行荧光法测