原代细胞培养2015

1、 定义和分类 重要性 常规方法 注意事项 示例 原代培养原代培养 （primaryprimary cultureculture） 从动物机体取出的进从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般代数后（一般1010代以代以 内）停止生长。内）停止生长。 细胞系细胞系 （ cellcell lineline） 从肿瘤组织从肿瘤组织 培养建立的培养建立的 细胞群或培细胞群或培 养过程中发养过程中发 生突变或转生突变或转 化的细胞，化的细胞， 在培养条件在培养条件 下可无限繁下可无限繁 殖殖 细胞株细胞株 （cellcell strain

2、strain） 从原代培养细从原代培养细 胞群中筛选出胞群中筛选出 的具有特定性的具有特定性 质或标志的细质或标志的细 胞群，能够繁胞群，能够繁 殖殖5050代左右，代左右， 在培养过程中在培养过程中 其特征始终保其特征始终保 持。持。 相关概念 如何界定原代培养和传代培养如何界定原代培养和传代培养 原代细胞vs细胞系 原代细胞的重要性 原代细胞的重要性-研究应用 原代细胞的重要性-临床应用 细胞治疗细胞治疗 原代细胞的重要性-干细胞应用 原代细胞的重要性原代细胞的重要性- -肿瘤免疫细胞治疗肿瘤免疫细胞治疗 CarT免疫治疗，主要应用在B细胞淋巴瘤治疗中 原代细胞培养的分类 从健康植株的特定

3、部位或组织，如根、茎、叶、花、果从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果 实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料， 称之为外植体。称之为外植体。 用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠，升汞和酒精用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠，升汞和酒精 等对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。严格控制无菌等对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。严格控制无菌 条件，这是获得培养成功的重要一步。条件，这是获得培养成功的重要一步。 外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织 分化出芽并可诱

4、导形成根的小植株。分化出芽并可诱导形成根的小植株。 1 1）植物细胞和组织培养技术）植物细胞和组织培养技术 2 2）动物细胞和组织培养技术）动物细胞和组织培养技术 动物细胞的生长与培养 动物细胞的特点动物细胞的特点 进化程度高进化程度高 结构、形态、成分复杂结构、形态、成分复杂 细胞间连接形式多样细胞间连接形式多样 生长相对缓慢生长相对缓慢 功能全面功能全面 体外培养细胞的分型 （一）贴附型（一）贴附型 成纤维细胞型成纤维细胞型 上皮型细胞上皮型细胞 游走细胞型游走细胞型 多形型细胞多形型细胞 （二）悬浮型（二）悬浮型 （三）半贴壁型（三）半贴壁型 （一）贴附型：（一）贴附型： 大多数培养细胞

5、大多数培养细胞贴附生长贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，属于贴壁依赖性细胞 贴附贴附: :是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存 在方式在方式 结果结果: : 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组 织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生 存和生长。存和生长。 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后培养时：这些细胞被放到体外环境中以后, ,同样需要贴附于同样需要贴附于 某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞某一固相表面才能生存和

6、生长，因而属于贴附型细胞 贴附贴附( (锚定或锚着锚定或锚着) )依赖型依赖型( (性性) )细胞细胞：唯有贴附于固相表面：唯有贴附于固相表面 才能生存的细胞才能生存的细胞 1 1、成纤维细胞型：、成纤维细胞型： 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨 细胞，血管内皮细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不胞体梭形或不 规则三角形规则三角形，胞质向外伸出，胞质

7、向外伸出2 23 3个长短不等的突个长短不等的突 起，中有卵圆形核起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，生长特点：排列成放射状，漩涡状漩涡状，并不紧靠连，并不紧靠连 成片，细胞成片，细胞细胞接触易断开而单独行动，游离细胞接触易断开而单独行动，游离 的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突 起起 2 2、上皮型细胞、上皮型细胞： 名称：仅形态上似体内，实际上不完全名称：仅形态上似体内，实际上不完全 相同相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞来源：来源于外胚层、内胚层细胞, , 如：如： 皮肤及其衍生物皮肤及其衍生物, ,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺

8、，肺泡, , 上皮性肿瘤上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞，形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不扁平，不 规则多角形规则多角形，中有圆形核，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠生长特点：易相连成片，相靠紧密相紧密相 连连成薄层成薄层铺石状生长时呈膜状移动，铺石状生长时呈膜状移动， 很少脱离细胞群而单个活动很少脱离细胞群而单个活动 3 3、游走细胞型：、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。 此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区 别。

9、别。 4 4、多型细胞型：、多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。规律和稳定的形态，可统归于此类。 （二）悬浮型：（二）悬浮型： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形， 不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小

10、细胞团 常用分离方法 常用分离方法 血液细胞血液细胞 梯度密度离心法梯度密度离心法 免疫磁珠法免疫磁珠法 流式细胞分选法流式细胞分选法 机体组织机体组织 组织块直接培养法（机械法）组织块直接培养法（机械法） 酶消化法酶消化法 胰酶胰酶 胶原蛋白酶胶原蛋白酶I I、IVIV等等 梯度密度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯 度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或 离心力场的作用使细胞分层、分离。离心力场的作用使细胞分层、分离。 常用的试剂：淋巴细胞分离液、常用的试剂：淋巴细

11、胞分离液、Ficoll-PaqueFicoll-Paque等等 免疫磁珠法 流式细胞分选法 血液细胞分离步骤 组织细胞分离步骤 细胞的培养和冻存 细胞生长曲线 细胞培养密度 冷冻保存要点 （1 1）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 -1 到到 -3-3速度降温，一直到速度降温，一直到-80-80以下，然后直接放入液氮中长期保存以下，然后直接放入液氮中长期保存 （2 2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于9090，无微生物污染。，无微生物污染。 （3 3）细胞浓度控制在：）细

12、胞浓度控制在：1 110106 61 110107 7/ml/ml。 （4 4）使用高浓度血清（）使用高浓度血清（30%30%） （5 5）使用合适的细胞冷冻保护剂（）使用合适的细胞冷冻保护剂（DMSODMSO、甘油）、甘油） 细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（5-10%5-10%，培养基（，培养基（60%60%），血清），血清 （30%30%）。）。 冷冻保存细胞的解冻与复苏 （1 1）快速解冻）快速解冻 （2 2）解冻操作过程动作要轻）解冻操作过程动作要轻 特别注意：特别注意： l解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞解冻时务必注意

13、安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞 冷冻管从液氮中取出，放入冷冻管从液氮中取出，放入3737水浴中。切不可直接用手，以免冻水浴中。切不可直接用手，以免冻 伤伤 l冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生 污染污染 无血清培养基 无血清培养基的应用 免疫细胞治疗免疫细胞治疗 干细胞治疗干细胞治疗 CHOCHO细胞体系细胞体系 特殊细胞培养：神经干细胞等特殊细胞培养：神经干细胞等 典型原代细胞分离示例 小鼠胚胎神经干细胞的分离示例 小鼠骨髓间充质干细胞分离示例 人脐带内皮祖细胞的分离示例 酶消化法酶消化法 总结

14、无菌操作无菌操作 环境、器材、实验操作环境、器材、实验操作 培养基培养基 有血清培养基有血清培养基 无血清培养基无血清培养基 特殊培养基特殊培养基 分离方法分离方法 细胞鉴定细胞鉴定 形态、存活率、功能形态、存活率、功能 冻存复苏冻存复苏 Yrgene Primary cell solution Cryopreserved at early passage Cells are frozen at P1 through P5 Early passage material ensures higher viability and optimal plating efficiency Performance tested Media, kit supplements and reagents are tested for optimal reliability Growth and morphology are assessed to ensure all compo