信号转导研究方法

1、信号转导研究方法 信号转导通路信号转导通路 研究策略和研究策略和 搞懂信号通路搞懂信号通路 查找文献，查找文献，了解信号系统的研究进展和热点了解信号系统的研究进展和热点 找到研究点找到研究点 信号转导研究方法 功能分析功能分析表达分析表达分析 如何分析信号蛋白？如何分析信号蛋白？ 何时何地表达何时何地表达 基因过表达基因过表达，或，或基因基因沉默沉默 ( (细胞水平和整体水平细胞水平和整体水平) ) 相互作用蛋白相互作用蛋白 立体论证立体论证 信号转导研究方法 基因水平基因水平 转录水平转录水平 转录后加工转录后加工 翻译水平翻译水平 翻译后加工翻译后加工 mRNA和蛋白质降解和蛋白质降解 蛋

2、白质基因表达可以在不同层次上调节蛋白质基因表达可以在不同层次上调节 信号转导研究方法 基因表达分析方法基因表达分析方法 启动子分析启动子分析: - EMSA - Reporter gene assay - CHIP assay - Nuclear Run-on assay - DNA Foot-printing assay - DNA truncation and site-directed mutagenesis 翻译水平分析翻译水平分析: - Western Blots - Immunocytochemistry Immunohistochemistry - Protein modific

3、ation - Proteomics 转录水平分析转录水平分析: - RT-PCR - Real Time PCR - In situ hybridization - Northern blots - RNase protection assay - Primer extention assay 比较转录组学比较转录组学: - Differential screening - Subtractive hybridization - Differential display - Array-based methods 信号转导研究方法 1. 蛋白质表达水平和细胞内定位研究蛋白质表达水平和细胞内定

4、位研究 信号蛋白分子表达水平检测信号蛋白分子表达水平检测: Western blot analysis. ELISA Proteomics 信号蛋白分子在细胞内定位研究信号蛋白分子在细胞内定位研究: : Immunohistochemistry / Immunocytochemistry Immunofluorescence (IF) Green fluorescent protein (GFP)-fusion protein typically, live cells. 信号转导研究方法 印迹技术印迹技术 blotting n将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加将在凝胶中分离的

5、生物大分子转移到固相化介质上，并加 以检测分析的技术。以检测分析的技术。 n应用：应用：DNA、RNA、蛋白质的检测、蛋白质的检测 DNA 印迹印迹: Southern blotting RNA 印迹印迹: Northern blotting 蛋白质印迹蛋白质印迹: Western blotting 信号转导研究方法 n又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上(NC(NC膜膜 ）, ,再与溶液中的抗体相互结合的技术。再与溶液中的抗体相互结合的技术。

6、n主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异 蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以 及蛋白质分子间的相互作用研究等。及蛋白质分子间的相互作用研究等。 Western blotting 信号转导研究方法 信号转导研究方法 信号转导研究方法 Electrophoresis 信号转导研究方法 转膜转膜 Protein HRP DAB H2O2 1Ab 2Ab 抽提细胞蛋白，定量抽提细胞蛋白，定量 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 与特异性抗体杂与特异性抗体杂 交。交。 根据标记物特点

7、显色根据标记物特点显色 信号转导研究方法 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜 目的蛋白质目的蛋白质 抗目的蛋白一抗抗目的蛋白一抗 标记的二抗标记的二抗 偶联的碱偶联的碱 性磷酸酶性磷酸酶 磷酸化生色体系磷酸化生色体系脱磷酸显色脱磷酸显色 采用采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图方法检测蛋白质原理示意图 信号转导研究方法 应用举例应用举例 n某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？ 分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量 相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳

8、 印迹（电转移）印迹（电转移） 杂交（抗体）杂交（抗体） 显色显色/ /显影显影 根据显影结果判断：根据显影结果判断： 内参内参 目标蛋白目标蛋白 检测标本很多的情况检测标本很多的情况下下WesternWestern 无法满足高通量的需求无法满足高通量的需求 信号转导研究方法 ELISA / Phosphospecific-ELISAs (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 检测蛋白质表达量或者活性状态检测蛋白质表达量或者活性状态 (化学修饰化学修饰-磷酸化磷酸化) 比比western blot更快速、更高效更快速、更高效. 信号转导研究方法 蛋白质组（蛋白质

9、组（proteome）：）： 一个基因组所表达的全部蛋白质一个基因组所表达的全部蛋白质. 蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics)： 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。 蛋白质组学蛋白质组学(Proteomics) 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表同一基因组在不同细胞、不同组织中的表 达情况各不相同；达情况各不相同； 在空间和时间上呈动态变化在空间和时间上呈动态变化 信号转导研究方法 蛋白质组学研究技术平台蛋白质组学研究技术平台 ( (高效率高效率, ,高通量高通量) ) n 双向电泳分离样品蛋白质双向电泳分离样品

10、蛋白质 n 蛋白质点的定位和切取蛋白质点的定位和切取 n 质谱分析质谱分析 信号转导研究方法 第一向：等电聚焦电泳第一向：等电聚焦电泳 （IEF） 信号转导研究方法 第二向：第二向：SDS-PAGE电泳电泳 信号转导研究方法 信号转导研究方法 免疫荧光技术免疫荧光技术 Immunofluorescence (IF) n利用某些荧光素如利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白等通过化学反应与抗体或其它蛋白 结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性 结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧结合，形成的荧光复合物在一

11、定波长光的激发下可产生荧 光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。 n采用流式细胞免疫荧光技术（采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测）可从单细胞水平检测 不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别 标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测 两种不同的分子（两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术），也可用多参数流式细胞术 对胞内多种分子进行检测。对胞内多种分子进行检测。 信号转导研究

12、方法 2. 蛋白质与蛋白质相互作用研究技术蛋白质与蛋白质相互作用研究技术: Co-IP（免疫共沉淀免疫共沉淀） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein GST pull-down assay Yeast two-hybrid assay FRET (fluorescence resonance energy transfer) assay 信号转导研究方法 agarose bead n IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质是

13、利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质 的的“protein A/G”能特异结合免疫球蛋白能特异结合免疫球蛋白FC片段的现象而发展片段的现象而发展 的方法。目前多用精制的的方法。目前多用精制的protein A/G预先结合固化在预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的上的 prorein A/G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 protein A 抗原抗原 抗体抗体 信号转导研究方法 Y A B Y 裂解细胞裂解细胞 免疫沉淀蛋白质免疫沉淀蛋白质X 免疫共沉

14、淀（免疫共沉淀（Co-IP）技术）技术 非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白 质间的相互作用被保留了下来。若用蛋白质质间的相互作用被保留了下来。若用蛋白质X的抗体免疫沉的抗体免疫沉 淀淀X，那么与，那么与X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步也能沉淀下来。进一步 进行进行Western Blot和质谱分析。常用于测定两种目标蛋白质和质谱分析。常用于测定两种目标蛋白质 是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用 搭档。搭档。 缺点：可能检测不到低亲和

15、力和瞬间的蛋白质相互作用。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用。 信号转导研究方法 Western Blot和质谱分析和质谱分析 信号转导研究方法 Co-IP工作示意图工作示意图 Co-immunoprecipitation binding wash elution Y Y Y Y Y 信号转导研究方法 GST融合蛋白进行融合蛋白进行Pulldown实验实验 GST pull-down assay 原理原理 将将GST融合蛋白融合蛋白(tagged protein (标记蛋白标记蛋白) or the bait (饵蛋白饵蛋白)，GST, His6, Flag, biotin )作为

16、探针，作为探针， 与溶液中的特异性搭档蛋白与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein, or prey被扑被扑 获蛋白获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀 GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发 现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启 用用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 信号转导研究方法 GST-Pulldown Assay 信号转导研究方法 转录激活因子转录激活

17、因子 DNA结合结构域结合结构域(BD) 转录激活结构域转录激活结构域(AD) 酵母双杂交技术酵母双杂交技术 酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的 研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。 n在酵母细胞中分析蛋白质相互作用。在酵母细胞中分析蛋白质相互作用。 n以真核细胞转录激活因子的结构为基础。以真核细胞转录激活因子的结构为基础。 信号转导研究方法 n将编码某一蛋白将编码某一蛋白X的的DNADNA序列与序列与DNADNA结合域结合域BDBD的编码序列融的编码序列融 合形成一个杂交体合形成一个杂交体(

18、 (“诱饵诱饵”bait)bait)，将编码另一蛋白，将编码另一蛋白Y的的 DNADNA序列与序列与DNADNA激活域激活域ADAD的编码序列融合形成另一个杂交的编码序列融合形成另一个杂交 体体( (“猎物猎物”或靶蛋白或靶蛋白prey or target protein);prey or target protein); n当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有 DNADNA结合位点的报告基因），若结合位点的报告基因），若X和和Y没有相互作用，则单没有相互作用，则单 独不能激活报告基因的转录；若独不能激活报告基因的转录；若X X和和Y

19、 Y可相互作用，则使可相互作用，则使 BDBD和和ADAD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因 的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X X 和和Y Y的相互作用。但限于核内表达的蛋白质的相互作用。的相互作用。但限于核内表达的蛋白质的相互作用。 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 信号转导研究方法 信号转导研究方法 荧光共振能量转移荧光共振能量转移(FRET)是对生物大分子之间相互作用是对生物大分子之间相互作用 定性、定量检测的一种有效方法，是在活体细胞中实时地对生定性、定量检测的一种有效方法，

20、是在活体细胞中实时地对生 物大分子之间的相互作用进行动态监测物大分子之间的相互作用进行动态监测. 两个携带不同荧光基团（如两个携带不同荧光基团（如GFP、YFP、CFP等）的大等）的大 分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一 个荧光基团（供体）向另一个荧光基团（受体）转移的现象。个荧光基团（供体）向另一个荧光基团（受体）转移的现象。 如果发生如果发生FRET，则供体信号将淬灭而受体信号将激活或增强，则供体信号将淬灭而受体信号将激活或增强. FRET 检测系统可以快速高效地捕获来自标定分子间相互作用检测系统可以快速高效地捕获来

21、自标定分子间相互作用 的短暂微弱的荧光信号，而以分子尺度分辨出供体的短暂微弱的荧光信号，而以分子尺度分辨出供体-受体的平受体的平 均距离，并能显示出受体均距离，并能显示出受体-供体的相互作用。供体的相互作用。 蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer 信号转导研究方法 以光线激发后，供体荧光基以光线激发后，供体荧光基 团团(ECFPX)会将激发能量转会将激发能量转 移至距离移至距离10100 以内的以内的 受体荧光基团受体荧光基团(EGFPY)，使，使 之发出荧光。通过检测受体之发出荧

22、光。通过检测受体 荧光基团激发的荧光即可确荧光基团激发的荧光即可确 认两蛋白质间的相互作用。认两蛋白质间的相互作用。 ECFP：强化型蓝荧光蛋白：强化型蓝荧光蛋白； EGFP：强化型绿荧光蛋白：强化型绿荧光蛋白 FRET 信号转导研究方法 3. 磷酸化蛋白质研究方法磷酸化蛋白质研究方法: Western blot with phospho-specific antibodies. ELISA Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis. n 激酶活性的测定激酶活性的测定 信号

23、转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对 这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。 常见激酶活性的测定有常见激酶活性的测定有PTK、PKC及及PI-3K等。均有商等。均有商 品化的试剂盒。品化的试剂盒。 信号转导研究方法 4. 基因转录活性检测基因转录活性检测 信号蛋白转录水平表达（信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测）的检测: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. “gene chip” to measure changes i

24、n gene expression at larger scales. 基因启动子基因启动子/增强子转录活性的检测增强子转录活性的检测: Transient or stable reporter assayluciferase (Luc) . 信号转导研究方法 RT- PCR 信号转导研究方法 Marker 组组1 组组2 内参基因内参基因 目的基因目的基因 RTRT： 以以polyTpolyT为引物，在逆转录酶为引物，在逆转录酶 催化下催化下cDNAcDNA合成合成 PCRPCR： 特异引物进行目的特异引物进行目的DNADNA的扩增的扩增 应用：应用： 1.1.获得目的基因（编码蛋白）获得目

25、的基因（编码蛋白） 2.2.比较不同条件下比较不同条件下mRNAmRNA变化变化 RT- PCR 信号转导研究方法 Real-time PCR 用于基因用于基因DNADNA拷贝数和拷贝数和mRNAmRNA表达定量分析表达定量分析 荧光染料：荧光染料： 每形成一个每形成一个DNA双链，双链， 就有一定数量的染料结就有一定数量的染料结 合上去，染料一结合就合上去，染料一结合就 产生荧光信号，信号强产生荧光信号，信号强 度与度与DNA分子总数目成分子总数目成 正比正比。 信号转导研究方法 TaqMan 探针探针 寡核苷酸探针的寡核苷酸探针的5端标记一个荧光报告基团端标记一个荧光报告基团 （repor

26、ter ），），3端标记一个荧光淬灭基团端标记一个荧光淬灭基团 （quencher ）。）。 信号转导研究方法 报告荧光基团与淬灭报告荧光基团与淬灭基团基团分离，荧光共振能量分离，荧光共振能量 转移不再发生，报告基团发绿色荧光转移不再发生，报告基团发绿色荧光 当激发光照射到探针时，被激发的报告基团当激发光照射到探针时，被激发的报告基团 将能量转移给附近的淬灭基团而不发光。将能量转移给附近的淬灭基团而不发光。 信号转导研究方法 每产生一条每产生一条DNADNA链，就切断一条探针，每链，就切断一条探针，每 切断一条探针，就产生一个单位信号，切断一条探针，就产生一个单位信号， 信号强度与结合探针的信

27、号强度与结合探针的DNADNA分子数成正比分子数成正比。 信号转导研究方法 5. 蛋白质与蛋白质与DNA相互作用的研究技术相互作用的研究技术: Gel shift (or electrophoretic mobility shift) assay (EMSA)typically, with smaller DNA sizes. Chromatin-immunoprecipitation (ChIP) assayto assess occupancy of DNA sites with specific factors in living cells. 信号转导研究方法 信号转导研究方法 Gel

28、 shift 信号转导研究方法 染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术 （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP） 体内分析蛋白质体内分析蛋白质-DNA相互作用相互作用 真核生物基因组真核生物基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋以染色质的形式存在。因此，研究蛋 白质与白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因 表达机制的基本途径。表达机制的基本途径。 CHIP的基本原理的基本原理: 在活细胞状态下固定蛋白质在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合复合 物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片

29、段，然物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然 后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得体内蛋白质片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得体内蛋白质 与与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。 信号转导研究方法 甲醛处理使蛋白质与染色质甲醛处理使蛋白质与染色质DNADNA交交 联；联； 超声波或酶处理使染色质超声波或酶处理使染色质DNADNA片段片段 化；化； 抗体沉淀蛋白质抗体沉淀蛋白质-DNA-DNA交联复交联复 合体（合体（IPIP）；）； 消化蛋白，解除交联，纯化消化

30、蛋白，解除交联，纯化DNADNA； 检测分析检测分析(PCR, qPCR, Microarray) 信号转导研究方法 6. 基因或蛋白质功能研究基因或蛋白质功能研究 改变基因结构改变基因结构 基因突变（点突变、缺失、融合等）基因突变（点突变、缺失、融合等） 将突变基因或蛋白引入细胞以检测其功能将突变基因或蛋白引入细胞以检测其功能 Dominant negative mutants (缺失结构域突变体) Ligand-binding site Phosphorylation site Docking site Protein-protein binding site (1)DNA binding

31、 site 信号转导研究方法 基因表达或蛋白质活性的抑制，观察表型变化推测基因功能基因表达或蛋白质活性的抑制，观察表型变化推测基因功能 RNAiuse of small interfering RNA (siRNA) to reduce specific mRNA levels. Antisense oligonucleotides Ribozyme Monoclonal Antibody Small inhibitor molecules：tyrosine kinase inhibitor (TKi) 在生物整体内改变基因表达或基因结构（转基因技术）在生物整体内改变基因表达或基因结构（转基因

32、技术） transgenic Knock-out 信号转导研究方法 RNA干扰技术干扰技术 RNA Interference (RNAi) 由双链由双链RNA 所引起的序列特异性基因沉默所引起的序列特异性基因沉默 信号转导研究方法 长双链长双链RNA被细胞源性的双链被细胞源性的双链 RNA特异的核酸酶特异的核酸酶 切成个碱基对的短切成个碱基对的短 双链双链RNA，称为小干扰，称为小干扰RNA 小干扰小干扰RNA与细胞源性的某些与细胞源性的某些 酶和蛋白质形成复合体，称为酶和蛋白质形成复合体，称为 RNA诱导沉默复合体，该复合诱导沉默复合体，该复合 体可识别与小干扰体可识别与小干扰RNA有同源有

33、同源 序列的序列的RNA，并在特异位点，并在特异位点 将该将该RNA切断。切断。 信号转导研究方法 RNAi实例实例(载体法载体法)： n 查找靶基因查找靶基因mRNA n 利用网络在线支持，寻找利用网络在线支持，寻找siRNA序列序列 n 根据查找的根据查找的siRNA序列，合成长链序列，合成长链oligo n 构建载体构建载体 n 转染转染 n 检测效应（包括干扰效应和生物学效应）检测效应（包括干扰效应和生物学效应） 信号转导研究方法 转基因：转基因： 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，导入将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，导入 基因的表达可引起生物体性状可遗传的改

34、变，称之为转基基因的表达可引起生物体性状可遗传的改变，称之为转基 因。因。 转基因动物：转基因动物： 以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合 并能遗传给后代的一类动物。并能遗传给后代的一类动物。 转基因技术转基因技术 transgenic technology 信号转导研究方法 转基因动物模型实验步骤转基因动物模型实验步骤: : 转基因载体的构建；转基因载体的构建； 将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞；将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子 宫内

35、；宫内； 对转基因动物进行鉴定。对转基因动物进行鉴定。 信号转导研究方法 转基因载体 结构基因 报告基因 增强子 启动子 受精 全能性细胞 注射 植入 假孕小鼠 后代 Southern blot RT-PCR Western blot 转基因小鼠转基因小鼠 信号转导研究方法 基因敲除技术基因敲除技术 Gene Knock-out 信号转导研究方法 定向插入定向插入(宿宿 主细胞染色体主细胞染色体DNA中中 使特定目使特定目 的基因在细胞内或生物体的基因在细胞内或生物体 内失活；内失活； 基因敲除技术基因敲除技术 Gene Knock-out 信号转导研究方法 n 信号转导中第二信使含量的测定信号转导中第二信使含量的测定 第二信使含量的高低同信号传递密切相关。 1.Ca2+的测定：的测定：原子光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标 记示踪法等。目前常用标记示踪法，即用荧光探针标记靶细胞。常用 的