酵母核糖核酸的分离及组分鉴定改

1、目的与要求目的与要求 1. 了解稀碱法提取了解稀碱法提取RNA的原理、方法的原理、方法 2. 2. 掌握核酸中掌握核酸中三大组分的鉴定方法三大组分的鉴定方法 原原 理理 v核糖核酸RNA：从细胞核和细胞质中分离出来的 化学物质。 在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用， RNA的结构和DNA的结构类似，都是由核苷酸按照 一定顺序排列成的长链。 RNA可以分为信使RNA、转运RNA、核糖体RNA以及 其他类型的RNA。 磷酸磷酸 碱基碱基 戊糖戊糖 酵母菌酵母菌 酵母中主要成分是酵母中主要成分是RNARNA（2.672.6710.0%)10.0%)，DNADNA很少很少 (0.03(0.030

2、.5160.516%)%)。 总总RNARNA的提取的提取: : 采用稀碱裂解法，乙醇沉淀采用稀碱裂解法，乙醇沉淀RNA, RNA, 洗涤除洗涤除 杂质；杂质； RNARNA组分鉴定组分鉴定: :硫酸可使硫酸可使RNARNA水解，再分别鉴定水解，再分别鉴定 1. 1. 核糖的鉴定核糖的鉴定苔黑酚苔黑酚(3,5(3,5二羟基甲苯二羟基甲苯) )法法 CHO CH CH CH CH2OH OH OH OH O CHO OH OH CH3 C O CH3 O CH3OH -H2O 浓酸 核糖 3，5-二羟甲苯 糠醛绿色化合物 墨绿色墨绿色 2. 2. 碱基的鉴定碱基的鉴定嘌呤碱嘌呤碱 嘌呤碱嘌呤碱+

3、 +过量浓氨水过量浓氨水+ +AgNOAgNO3 3 絮状嘌呤银化合物 絮状嘌呤银化合物 3. 3. 磷酸的测定磷酸的测定定磷法定磷法 ( (NHNH4 4) )2 2MoOMoO4 4+H+H2 2SOSO4 4 H H2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4) )2 2SOSO4 4 H H3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO4 4 H H3 3P(MoP(Mo3 3O O10 10) )4 4+12H +12H2 2O+12HO+12H2 2O O H H3 3P(MoP(Mo3 3O O10 10) )4 4 Mo Mo2 2O O3 3MoOMoO3 3( (

4、钼蓝）钼蓝） 试剂和器材试剂和器材 v试剂：试剂： 0.040.04M NaOHM NaOH；酸性乙醇溶液；酸性乙醇溶液, , 95%95%乙醇乙醇 1.5M1.5M硫酸；硫酸； 浓氨水，浓氨水，0.1M0.1M硝酸银；硝酸银； 三氯化铁浓盐溶液三氯化铁浓盐溶液 , ,苔黑酚乙苔黑酚乙 醇；醇； 定磷试剂定磷试剂 v器材器材 研钵，天平；研钵，天平； 沸水浴，低速台式离沸水浴，低速台式离 心机。心机。 n 材料材料 干酵母干酵母 一一. .提取步骤改动：提取步骤改动： 1.1. 5 5g g酵母中加入酵母中加入30 30 mlml 0.04M NaOH 0.04M NaOH，在研钵中研磨在研钵

5、中研磨 均匀，转入大试管，沸水浴均匀，转入大试管，沸水浴20 20 minmin，30003000转离心转离心 1010minmin，取上清，弃沉淀。取上清，弃沉淀。 2.2. 上清液上清液慢慢慢慢倾入倾入10 10 ml ml 酸性乙醇中，边加边搅，酸性乙醇中，边加边搅， 沉淀沉淀RNARNA静置静置5min5min， 30003000转离心转离心10min10min，弃上清，弃上清， 取沉淀。取沉淀。 3.3.将沉淀用将沉淀用95%95%乙醇洗两次，约乙醇洗两次，约6 6毫升毫升/ /管，用于除管，用于除 去表面杂质。第一次将沉淀捣散后再去表面杂质。第一次将沉淀捣散后再离心离心5min5m

6、in； 第二次将沉淀捣散第二次将沉淀捣散过滤过滤，旨在将沉淀誊出来，放，旨在将沉淀誊出来，放 在滤纸上凉干，在滤纸上凉干，称量称量。（差减法称量，滤纸应提（差减法称量，滤纸应提 前称好）前称好） 4.4.将所有提取物转移到小三角瓶中，加硫酸进行水将所有提取物转移到小三角瓶中，加硫酸进行水 解，再分别鉴定组份。解，再分别鉴定组份。 二二. . 鉴定鉴定 1.鉴定磷组分可适当增加，效果更好。 2.氨水过量太多也会使沉淀消失；先加硝酸银后加 氨水效果明显。 n苔黑酚显色的特异性较差，凡戊糖都有此反应。 n准微量DNA无影响，较多DNA存在，亦有干扰。 离心注意事项：离心注意事项： 1.样品倒入玻璃离

7、心管不能太满； 2.离心前玻璃离心管（套上塑料管套）放在天平上 平衡好； 3.离心机中对称放置； 4.接通电源前确认速度旋钮是否归零，调节定时旋 钮设定时间，按开始键开始离心，缓慢调节速度 至实际需要速度。 思考题思考题 1.为什么测定嘌呤碱而不是嘧啶碱？ 2.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2. 2. 碱基的鉴定碱基的鉴定嘌呤碱嘌呤碱 嘌呤碱嘌呤碱+ +过量浓氨水过量浓氨水+ +AgNOAgNO3 3 絮状嘌呤银化合物 絮状嘌呤银化合物 3. 3. 磷酸的测定磷酸的测定定磷法定磷法 ( (NHNH4 4) )2 2MoOMoO4 4+H+H2 2SOSO4 4 H H2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4) )2 2SOSO4 4 H H3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO4 4 H H3 3P(MoP(Mo3 3O O10 10) )4 4+12H +12H2 2O+12HO+12H2