重组致倦库蚊对常用农药的敏感谱与代谢谱分析

1、1 2 3 4 目目 录录 u 研究背景研究背景 u 研究内容研究内容 u 实验结果实验结果 u 结果分析结果分析 u 工作计划工作计划 1983年我国农药使用量年我国农药使用量 为为0.86亿吨亿吨 2003年农药使用年农药使用 量量1.32亿吨亿吨 40% 50% 水稻水稻棉花棉花 农药使用过农药使用过 量所占比例量所占比例 20122012年年1 1月绿色和平先后在北月绿色和平先后在北 京、成都和海口对九个茶叶京、成都和海口对九个茶叶 品牌进行了随机抽样调查品牌进行了随机抽样调查: : u 被调查的被调查的九个品牌九个品牌的所有的所有 茶叶样品上均含有至茶叶样品上均含有至少三种少三种 农

2、药残留农药残留; ; u 检出的检出的农药种农药种类总数高达类总数高达 2929种种; ; u 六个样本六个样本含有含有十种以上农十种以上农 药残留药残留，而，而日春日春803803铁观音铁观音竟竟 含有多达含有多达1717种种农药残留。农药残留。 u目前主要的检测方法：目前主要的检测方法：薄层色谱法、气相色谱薄层色谱法、气相色谱 法、高效液相色谱法和快速检测法如酯酶抑制法法、高效液相色谱法和快速检测法如酯酶抑制法 及其基础上发展形成的酶生物感应器等。及其基础上发展形成的酶生物感应器等。 薄层色谱法薄层色谱法：准确度不高：准确度不高 气相色谱法、液相色谱法：气相色谱法、液相色谱法：灵敏度好，准

3、确度高，灵敏度好，准确度高， 但需要的仪器设备投入大，操作复杂，检测成本高，但需要的仪器设备投入大，操作复杂，检测成本高， 也不便于现场检测。也不便于现场检测。 以酯酶为基础的快速检测法：具有以酯酶为基础的快速检测法：具有前处理简便前处理简便、检测检测 时间短时间短、所需设备简单所需设备简单和和适于现场测定适于现场测定等优点，但受等优点，但受 到酶源数量、灵敏度、选择性和稳定性等因素影响。到酶源数量、灵敏度、选择性和稳定性等因素影响。 因此，因此，寻求稳定、高质量的酶源是关键寻求稳定、高质量的酶源是关键。 u 致倦库蚊酯酶致倦库蚊酯酶 v 致倦库蚊全基因组序列测定完成，为研究库致倦库蚊全基因组

4、序列测定完成，为研究库 蚊体内蚊体内酯酶同工酶基因酯酶同工酶基因提供了信息基础提供了信息基础，亦为开亦为开 发和利用库蚊酯酶用于发和利用库蚊酯酶用于农药残留快速检测和农药农药残留快速检测和农药 污染治理污染治理提供了提供了基因资源基因资源。 v致倦库蚊是世界上入室吸血骚扰的主要蚊种和致倦库蚊是世界上入室吸血骚扰的主要蚊种和 班氏丝虫病的主要传病媒介。近几年来，由于化班氏丝虫病的主要传病媒介。近几年来，由于化 学杀虫剂大量使用，导致库蚊普遍产生抗药性。学杀虫剂大量使用，导致库蚊普遍产生抗药性。 因此，抗药致倦库蚊中的因此，抗药致倦库蚊中的酯酶还可为环境中农药酯酶还可为环境中农药 污染的生物修复提

5、供丰富酶源。污染的生物修复提供丰富酶源。 u对对致倦库蚊酯酶致倦库蚊酯酶基因基因CqE9进行生物信息学进行生物信息学分析分析， 从而从而制定制定相应的相应的实验方案实验方案 u克隆克隆致倦库蚊酯酶致倦库蚊酯酶基因基因CqE9 u构建构建重组表达质粒重组表达质粒pET32-CqE9 u重组表达载体在大肠杆菌重组表达载体在大肠杆菌Rosetta菌株中的菌株中的表达表达 u致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白重组蛋白纯化纯化与与酶活分析酶活分析 致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因 CqE9 u酯酶基因酯酶基因CqE9是从致是从致 倦库蚊倦库蚊4龄幼虫中克隆获龄幼虫中克隆获 得的，基因得的，

6、基因ORF全长全长 1623bp，编码，编码540aa u图为图为致倦库蚊致倦库蚊CqE9基基 因因ORF及其推测的氨基及其推测的氨基 酸序列酸序列 图为图为 CqE9疏水性分析疏水性分析 注：注：1. 0 1. 0 以上表示疏水性，分值越高疏水性越强以上表示疏水性，分值越高疏水性越强 2. 0 2. 0 以下表示亲水性，分值越小亲水性越强以下表示亲水性，分值越小亲水性越强 利用利用ProtScale程序程序 分析分析CqE9蛋白的疏水蛋白的疏水 性，该蛋白的疏水性性，该蛋白的疏水性 最大值为最大值为2.411，最小，最小 值为值为-2.633；由于该氨；由于该氨 基酸序列亲水性明显基酸序列亲

7、水性明显 强于疏水性，故推测强于疏水性，故推测 CqE9蛋白为亲水性蛋蛋白为亲水性蛋 白。白。 利用利用SignalP 4.0 服务器分析发现服务器分析发现 CqE9不存在信号肽不存在信号肽 经经MHMM服务服务 器对器对CqE9跨膜分跨膜分 析，发现不存在析，发现不存在 跨膜结构。跨膜结构。 u 利用利用PROSITE分析分析CqE9序列的功能区，发序列的功能区，发 现在现在178-193bp区域存在羧酸酯酶区域存在羧酸酯酶B型丝氨酸活型丝氨酸活 性位点性位点(Carboxylesterases type-B serine active site)：FGGdpknItLfGeSAG。 综上，

8、致倦库蚊综上，致倦库蚊CqE9基因为羧酸酶酯基因为羧酸酶酯 基因，基因，ORF全长全长1623bp，编码，编码540aa，不，不 含信号肽序列，不存在跨膜结构区域。含信号肽序列，不存在跨膜结构区域。 v 致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因CqE9重组表达载体构建与原核表达重组表达载体构建与原核表达 引物序列为引物序列为: Primer1： 5-CCA TGG CTG ATG GAC GTC GAA CAT Primer2： 5-GGC CGC TCG AGC TAA TAA AGC TTA TC M 1 M: DNA Marker；1:PCR产物产物 1.6kb v 致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶

9、基因CqE9重组表达载体构重组表达载体构 建与原核表达建与原核表达最佳表达条件最佳表达条件 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 泳道泳道1 1、3 3、5 5分别为分别为 IPTGIPTG终浓度为终浓度为0.5 mM0.5 mM诱导诱导 3h3h、2h2h、1h1h后的细菌匀浆后的细菌匀浆 液上清；泳道液上清；泳道2 2、4 4、6 6分分 别为别为IPTGIPTG终浓度为终浓度为0.5 mM0.5 mM 诱导诱导3h3h、2h2h、1h1h后的细菌后的细菌 匀浆液沉淀；匀浆液沉淀； pET32-CqE9在不同诱导表达条件下的在不同诱导表达条件下的SDS-PAGE电泳图电

10、泳图 泳道泳道M为蛋白为蛋白Marker（分子量条带自上而下分别为（分子量条带自上而下分别为170KD、 130 KD 、95 KD 72 KD 、55 KD、43 KD 和和34KD） 箭头所示为箭头所示为 目的融合蛋目的融合蛋 白白 泳道泳道7 7、9 9分别为分别为IPTGIPTG终浓度为终浓度为 0.25 0.25 mMmM和和0.1 0.1 mMmM诱导诱导2h2h后的细后的细 菌匀浆液上清；泳道菌匀浆液上清；泳道8 8、1010分别分别 为为IPTGIPTG终浓度为终浓度为0.25 0.25 mMmM和和0.1 0.1 mMmM诱导诱导2h2h后的细菌匀浆液沉淀；后的细菌匀浆液沉淀

11、； 泳道泳道1111、1212分别诱导分别诱导3hr3hr的含的含 pET-32a(+)pET-32a(+)空载体的菌蛋白上清空载体的菌蛋白上清 和沉淀；和沉淀； u诱导表达诱导表达最佳最佳条件为条件为 0.1mM IPTG0.1mM IPTG在在2828o oC C下诱导表下诱导表 达达2hr2hr v 致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白纯化重组蛋白纯化His亲和层析法亲和层析法 酶液酶液 酶活力酶活力 （mOD/min/g） 蛋白量蛋白量 （mg） 比率比率 未诱导酶粗提液未诱导酶粗提液7.6100.7480.2200.085 诱导酶粗提液诱导酶粗提液20.3342.1770

12、.1580.0201.0 诱导酶流出液诱导酶流出液6.4370.6480.0860.006 诱导酶清洗液诱导酶清洗液119.1720.5540.0220.000 诱导酶清洗液诱导酶清洗液2258.48323.5940.0010.001 诱导酶洗脱液诱导酶洗脱液442.20522.9100.0160.00121.75 注注: 表中显示为重组酶蛋白纯化各部分酶活性表中显示为重组酶蛋白纯化各部分酶活性 v 致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白纯化重组蛋白纯化His亲和层析法亲和层析法 泳道泳道1 1为未经诱导的细菌为未经诱导的细菌 匀浆液上清；泳道匀浆液上清；泳道2 2为经诱为经诱 导的

13、细菌匀浆液上清；泳道导的细菌匀浆液上清；泳道 3 3为诱导的细菌匀浆液上清为诱导的细菌匀浆液上清 经过经过HisHis亲和柱的流出液（亲和柱的流出液（ Flow throughFlow through）；泳道）；泳道4 4、5 5 分别流经分别流经HisHis亲和柱的清洗亲和柱的清洗 液；泳道液；泳道6 6为洗脱液。箭头为洗脱液。箭头 所示为目的融合蛋白。所示为目的融合蛋白。 M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 pET32-CqE9重组蛋白纯化的重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图电泳图 泳道泳道M： 蛋白蛋白Marker（分子量条带自上而下分别为（分子量条带自上而下分别为

14、170KD 、130 KD 、95 KD 72 KD 、55 KD、43 KD 和和34KD） u 结果表明利用结果表明利用HisHis亲和层析亲和层析 方法可有效纯化重组蛋白，纯方法可有效纯化重组蛋白，纯 化效率在化效率在21.7521.75倍。倍。 v 致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因CqE9重组蛋白酶活分析重组蛋白酶活分析 化合物化合物面积面积比率比率 A3-PBA32.20.056 氯菊酯氯菊酯576.6- B3-PBA30.40.065 氯菊酯氯菊酯466.7- C3-PBA61.00.131 氯菊酯氯菊酯464.0- 图为重组酶蛋白对氯菊酯的离体代谢图为重组酶蛋白对氯菊酯的离体代谢

15、HPLC分析分析 A: 阴性对照（不含酶液）阴性对照（不含酶液） B: 阳性对照（热灭活酶液）阳性对照（热灭活酶液） C: 处理（活性酶液）。其中，比处理（活性酶液）。其中，比 率率= 3-PBA面积面积 / 氯菊酯面积。氯菊酯面积。 结果分析结果分析 u 成功成功克隆克隆致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因CqE9，成功构建成功构建 pET32-CqE9 重组质粒；重组质粒； u 探索得最佳探索得最佳诱导条件诱导条件：0.1mM IPTG在在28oC下下 诱导表达诱导表达2hr； u 探索得最佳探索得最佳纯化方法纯化方法为为His亲和层析法亲和层析法。 结果分析结果分析 u重组酶蛋白在重组酶蛋白

16、在5端含有部分的载体氨基酸序列端含有部分的载体氨基酸序列 （包括（包括His-tag等），是否会对酶活性及其酶学等），是否会对酶活性及其酶学 特征产生影响，尚不清楚；特征产生影响，尚不清楚； u在重组酶蛋白对农药代谢分析时拟采用在重组酶蛋白对农药代谢分析时拟采用GC-MS 方法，以提高检测灵敏度，但相关的检测条件方法，以提高检测灵敏度，但相关的检测条件 尚待优化；尚待优化； u检测工作量大。检测工作量大。 实验计划实验计划 u分析含有分析含有His标签和不含有标签和不含有His标签的重组酶蛋标签的重组酶蛋 白的酶学特征，明确是否存在差异；白的酶学特征，明确是否存在差异； u继续开展酶学特征分析

17、，包括不同温度、继续开展酶学特征分析，包括不同温度、pH 值和不同抑制剂对酶活性的影响；值和不同抑制剂对酶活性的影响； u重组酯酶蛋白对不同农药的代谢活性测定。重组酯酶蛋白对不同农药的代谢活性测定。 40% 50% 水稻水稻棉花棉花 农药使用过农药使用过 量所占比例量所占比例 u 致倦库蚊酯酶致倦库蚊酯酶 v 致倦库蚊全基因组序列测定完成，为研究库致倦库蚊全基因组序列测定完成，为研究库 蚊体内蚊体内酯酶同工酶基因酯酶同工酶基因提供了信息基础提供了信息基础，亦为开亦为开 发和利用库蚊酯酶用于发和利用库蚊酯酶用于农药残留快速检测和农药农药残留快速检测和农药 污染治理污染治理提供了提供了基因资源基因

18、资源。 v致倦库蚊是世界上入室吸血骚扰的主要蚊种和致倦库蚊是世界上入室吸血骚扰的主要蚊种和 班氏丝虫病的主要传病媒介。近几年来，由于化班氏丝虫病的主要传病媒介。近几年来，由于化 学杀虫剂大量使用，导致库蚊普遍产生抗药性。学杀虫剂大量使用，导致库蚊普遍产生抗药性。 因此，抗药致倦库蚊中的因此，抗药致倦库蚊中的酯酶还可为环境中农药酯酶还可为环境中农药 污染的生物修复提供丰富酶源。污染的生物修复提供丰富酶源。 致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因 CqE9 u酯酶基因酯酶基因CqE9是从致是从致 倦库蚊倦库蚊4龄幼虫中克隆获龄幼虫中克隆获 得的，基因得的，基因ORF全长全长 1623bp，编码，编码540aa u图为图为致倦库蚊致倦库蚊CqE9基基 因因ORF及其推测的氨基及其推测的氨基 酸序列酸序列 结果分析结果分析 u 成功成功克隆克隆致倦库蚊酯酶基因致倦库蚊酯酶基因CqE9，成功构建成功构建 pET32-CqE9 重组质粒；重