分子生物学工具酶课件

1、分子生物学工具酶分子生物学工具酶 中晶生物 1分子生物学工具酶 工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分 子的制备、切割、修饰、扩增, 核酸分子的标记以及 它们的核苷酸序列测定的酶。 概概 述述 分类：分类： u 限制性内切酶 u 连接酶 u 逆转录酶 u DNA、RNA聚合酶 u 其它酶类 大多数来自不同 的微生物和噬菌体 少数酶来自动物 和动物病毒 另一些工具酶编 码的基因也被克隆出 来, 并用大肠杆菌细 胞来生产这些工具酶。 2分子生物学工具酶 一、限制性内切酶 5-GA A T T C-3 3-C T T A AG-5 EcoRI #ER02715000u #ER0272 5x50

2、00u #ER0273 H,25000u 市场容量：市场容量：1.5亿美金亿美金 3分子生物学工具酶 其命名以该酶来源的原核生物的名称为依据。 第一个大写字母：取自于属名的第一个字母 第二、三个小写字母：取自于种名的前两个字母 字母后面罗马字：该种生物中不同限制酶分离先后顺序 限制酶名称的前三个字母常用斜体或加下横线表示 限制酶的命名限制酶的命名 分离纯化：几千种限制性内切酶 商品化：200多种限制性内切酶 限制酶的种类限制酶的种类 4分子生物学工具酶 限制性内切酶 5分子生物学工具酶 兰白反应兰白反应 推荐缓冲液推荐缓冲液 作用最适温作用最适温 度度 作用产物连作用产物连 接效率接效率 星号

3、活星号活 性性 GC甲基化甲基化 末端失活末端失活 高浓度高浓度 Genome Qualified 限制性内切酶说明书限制性内切酶说明书 6分子生物学工具酶 Fermentas公司 30多年研发生产历史，提供200多种高质量的工具酶 通过ISO9002国际质量体系认证 v 精湛的实验室研发技术和实力 具有全球第二大的产限制酶的菌株 (2500株)库 REBASE 中30% 限制酶经过Fermentas的鉴定 30%II型限制修饰相关基因在Fermentas得到克隆 全球率先合成了“人造”酶(Eco57MI, N.Bpu10I) v 生产中执行最高级别的生产标准（LO Test） v 致力于通过

4、提高生产效率从而提升产品质量和价格竞争力 v 全球限制性内切酶(REs)生产的领先企业 v 市场份额：20左右，个别国家超过30的市场占有率 7分子生物学工具酶 执行最严格生产标准 PureExtreme v 自 1996 年以来，只有Fermentas始终执行分子生物学产品生产 中最严格的纯度标准 “标记寡核苷酸测试”（ the Labeled Oligonucleotide test，”LO” test） v 独有的“标记寡核苷酸测试” 确保 Fermentas 产品达到 PureExtreme级别 v 在限制酶、 dNTPs、 DNA/RNA 修饰酶等的生产中都进行了 “标记寡核苷酸测试

5、” 传统分析方法包括：非特异性核酸酶内切分析、核酸外切 酶分析、连接重切分析、蓝白斑筛选分析等。 但是要检测痕量污染的内切、外切核酸酶，磷酸酶，必需但是要检测痕量污染的内切、外切核酸酶，磷酸酶，必需 选择更高灵敏度的检测方法：选择更高灵敏度的检测方法：LO Test 8分子生物学工具酶 Labeled Oligonucleotide (LO) test A Invitrogen B Roche C NEB D Stratagene E Promega F Fermentas 9分子生物学工具酶 不同供应商RE LO检测分析 - purecontaminatedminor contaminati

6、onX * 10分子生物学工具酶 50 60 69 60 67 69 62 47 100 93 100100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % 1996 2001 通过通过LO检测的检测的REs(%) RocheInvitrogen NEBStratagene Promega Fermentas 11分子生物学工具酶 PureExtreme 限制性内切酶优势 v 所有Fermentas内切酶都达到 PureExtreme（致纯） 最高品质保证 v 产品投诉少 v 严格的批间一致性 v 保证产品质量稳定性 v 几乎所以的酶都采用标准浓度 10 units/l

7、v 实时质量监督 12分子生物学工具酶 所有Fermentas RE在优化Buffer中有100%活性 Easy-to-use Five Buffer Plus System 每个Fermentas RE含两种buffer： - 颜色区分，优化buffer： blue (B+) green (G+) orange (O+) red (R+) yellow (Y+/Tango) 和 - Universal Y+/Tango Double Digest buffer 浓度优化的BSA预先加入所有RE缓冲液中 13分子生物学工具酶 改进的 REsearch engine /research/app

8、14分子生物学工具酶 DoubleDigestion，双酶切，双酶切 http:/ 15分子生物学工具酶 DoubleDigest 提供DD最佳反应条件 http:/ 16分子生物学工具酶 Fermentas RE畅销排行榜（Top 20） v BamHI v BcuI (SpeI) v BglII v EcoRI v Eco47III v Eco57I v HindIII v MboI v MnlI v NotI v NcoI v NdeI v NheI v PaeI (SphI) v SacI v SalI v TaiI (MaeII) v Tru1I (MseI) v XbaI v Xh

9、oI 补充：补充：PstI 17分子生物学工具酶 与竞争对手的比较 v LO 测试 达到PureExtreme: 无其它 活性的污染 v 种类第二多 v ISO9002 认证和质量控制 v Five Buffer Plus System，加有 BSA v Y+/Tango，通用双酶切buffer v 列出有效期, 通过实时监控保证100活 性 v 价格优势 v 未经LO测试, 但有很多 重组内切酶 v 种类第一多 v 无认证，质量控制未核 实 v 单独提供BSA v 无双酶切用buffer v 仅有出厂化验日期, 距客 户购买日期可能会有一 年之久 v 价格相当 Fermentas vs NE

10、B 18分子生物学工具酶 与竞争对手的比较 v LO 测试 达到PureExtreme: 无其它 活性的污染 v 种类第二多 v ISO9002 认证和质量控制 v Five Buffer Plus System，加有 BSA v Y+/Tango，通用双酶切buffer v 列出有效期, 实时监控保证100活性 v 价格优势 v 未经LO测试, v 种类较少，约100种 v 有认证，质量控制不严 v Buffer中加有BSA v 无双酶切用buffer v 列出有效期 v 价格相当 Fermentas vs Takara 19分子生物学工具酶 与竞争对手的比较 v LO 测试 达到PureE

11、xtreme: 无其它 活性的污染 v 内切酶种类第二多 v ISO9002 认证和质量控制 v 列出有效期, 通过实时监控保证100活 性 v Five Buffer Plus System，加有 BSA v Y+/Tango，通用双酶切buffer v 专注于内切酶方面 v 价格优势 v 未经 LO测试 v 内切酶种类少 v 有认证 v 11种 buffers及 Multi- Core 4, 不提供BSA v 未提供双酶切的详细信息 v 非主要产品线 v 大幅度折扣 Fermentas vs Promega 20分子生物学工具酶 与竞争对手的比较 v LO 测试 达到PureExtreme

12、: 无其它 活性的污染 v 内切酶种类第二多 v ISO9002 认证和质量控制 v Five Buffer Plus System，加有 BSA v Y+/Tango，通用双酶切buffer v 价格优势 v 未经 LO测试 v 有认证 v 非主要产品线 v 9种 buffers, 不提供 BSA v 未提供双酶切的详细信 息 v 大幅度折扣 Fermentas vs Invitrogen 21分子生物学工具酶 FastDigest Restriction Enzymes 22分子生物学工具酶 FastDigest 限制性内切酶 vFastDigest 5min digestion 1l o

13、f enzyme 37oC temperature ONE buffer For ALL FastDigest enzymes 超过超过70多种多种FastDigest酶酶 数量快速增长数量快速增长 23分子生物学工具酶 Fermentas Average Attention-getting74%58% Believable86%75% Informative84%64% Ad characteristics Score 产品特点 v 独特的产品线 v 酶切质粒DNA只需5 min at 37C v 特殊的形式：1l enzyme v 无需换算酶切单位 v 通用Buffer，针对所有的酶切实验

14、 v 一种温度：37C反应 v 200ng 纯化的质粒DNA (5 min酶切) v 适合单酶切、双酶切和三酶切反应 v 操作简单：无需考虑酶量、Buffer、温 度和星活性 客户定位客户定位 24分子生物学工具酶 基因的体外突变等诸方面 限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用 各种DNA分子的体外重组 限制酶谱的绘制 基因的亚克隆分析 基因和染色体结构的分析 25分子生物学工具酶 限制性内切酶使用常见问题分析（一）限制性内切酶使用常见问题分析（一） Q1、DNA完全没有被内切酶切割完全没有被内切酶切割 内切酶失活：标准底物检测酶活性 DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子：将DN

15、A过柱 纯化，乙醇沉淀DNA 条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳 DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对DNA甲基化不敏感的同 裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）：换用不同切割非甲基化 位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至 dcm+ dam+菌株中扩增 DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与DAN混匀进行切割验证 1)DNA不存在该酶识别顺序 ：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化 进行验证 26分子生物学工具酶 限制性内切酶使用常见问题分析（二）限制性内切酶使用常见问题分

16、析（二） Q2、DNA切割不完全切割不完全 内切酶活性下降：用5-10倍量过量消化 内切酶稀释不正确 ：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 DNA不纯，反应条件不佳 ：同上 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 ：同上 部分DNA溶液粘在管壁上 ：反应前离心数秒 内切酶溶液粘度大，取样不准 ：将内切酶稀释，增大取样体积 酶切后DNA粘末端退火 ：电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后 置冰浴骤冷 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 ：使用标准反应缓冲液 及温度，避免强烈振荡 过度稀释使酶活性降低 ：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 反应条件不适 ：使用最佳反应体系 1)

17、识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 ：加大酶量5-10倍 27分子生物学工具酶 限制性内切酶使用常见问题分析（三）限制性内切酶使用常见问题分析（三） Q3、内切酶保存期内快速失活、内切酶保存期内快速失活 保存温度不当 ：贮藏在含50%甘油的贮藏液中，-20低温保存 以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用 贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液 1)低蛋白浓度：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存 Q4、酶切后的、酶切后的DNA片段连接效率低片段连接效率低 含磷酸盐的浓度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 内切酶失活不全或含有ATP酶：内切酶失活不全或含有ATP酶 平末端连接

18、：加大T4 DNA Ligase用量 外切酶污染：减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA 1)连接缓冲液不合适 ：重新配制连接缓冲液 28分子生物学工具酶 限制性内切酶使用常见问题分析（四）限制性内切酶使用常见问题分析（四） Q6、电泳后、电泳后DNA片段的带型弥散，不均一片段的带型弥散，不均一 DNA上结合有蛋白质：电泳前上样液65加热5min，并加 入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化 1)内切酶中含有DNA外切酶：减少酶用量或消化时间，换用 新包装的酶 Q5、DNA片段数目多于理伦值片段数目多于理伦值 内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低， Mn2+的存在及酶：

19、DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量 其它内切酶污染：用DNA作底物检查酶切结果 1)底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，纯化DNA片段 Q7、酶切后没有观察到、酶切后没有观察到DNA片段的存在片段的存在 DNA定量错误（如RNA含量较高） ：用RNA酶A（无DNA酶） 100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量 1)在酶切反应液中形成非特异的沉淀 ：在反应前透析DNA样品或用 酒精沉淀二次 29分子生物学工具酶 DNA/RNA 修饰酶 30分子生物学工具酶 v T4 DNA Ligase (LO tested) v Klenow fragment v T4 Polynu

20、cleotide Kinase v T4 DNA Polymerase v RevertAid M-MuLV Reverse transcriptases (LO tested) v Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (LO tested) v Ribonuclease Inhibitor v Ribonucleases v Calf Intestine Alkaline Phosphatase v Shrimp Alkaline Phosphatase v Proteinase K Fermentas畅销修饰酶 31分子生物学工具酶 T4 DNA L

21、igase LO tested v 单位： Fermentas 国际Weiss unit (ATP-PP exchange) NEB 粘端连接单位 1 Weiss单位 200粘端连接单位 相关产品： Rapid DNA Ligation Kit Rapid DNA Ligation & Transformation Kit 32分子生物学工具酶 Reverse transcriptases AMV： 从禽类成骨髓细胞瘤病毒中分离，有RNase H活性，42时比M- MuLV稳定，最高逆转录温度高达72度（Finnzymes）。增加逆转录的特 异性，适合具有二级结构的模板RT RevertAid

22、 M-MuLV (LO Test)： 从莫洛尼鼠白血病毒中分离，有RNase H活性。42度逆转录，最长 可获得13kb的cDNA。 M-MuLV (RNase H- ) (LO Test)： 从莫洛尼鼠白血病毒中分离，消除了RNase H活性，适合合成全长 的cDNA。 42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA，产量比含有RNase H 活性的酶要高很多。 33分子生物学工具酶 Ribonuclease Inhibitors（RNA酶抑制剂） 概述 v 非共价1:1结合RNase，抑制RNases - A, B, C活性。 v 对Bacterial RNases H, T1, 1, S1, U1, U2, CL3无效 v LO Test：超纯，无其它酶蛋白污染 v 作用温度范围：25-55度，最佳反应稳定37度 v 适用PH值范围5.0-9.0 应用： v RNA分离与纯化 v 体外转录，保证RNA转录本的完整性 v cDNA合成： 保护