荧光显微镜分析

1、 保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性 荧光波长激发波长荧光波长激发波长 荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率荧光效率 自发荧光自发荧光 二次荧光二次荧光 抗体荧光技术抗体荧光技术 自发荧光（不加染色）自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色有些物质不加染色,也能发出荧光（自发荧光也能发出荧光（自发荧光 或原发荧光）或原发荧光）,但在医学和生物学领域中，但在医学和生物学领域中， 只有很少物质具有自发荧光。只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光（用化学染色）二次荧

2、光（用化学染色） 非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用 荧光色素染色荧光色素染色,由荧光色素产生荧光（二次由荧光色素产生荧光（二次 荧光）荧光）,以便进行观察。对特定物体选择合以便进行观察。对特定物体选择合 适的荧光色素，该物体就能和周围的组织适的荧光色素，该物体就能和周围的组织 或细胞区别出来而可以观察到。或细胞区别出来而可以观察到。 抗体荧光技术（用免疫染色）抗体荧光技术（用免疫染色） 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这 一个事实一个事实,有意识地使带荧光标记的抗体和有意识地使带荧光标记的抗体和 标本中的抗原

3、进行抗原标本中的抗原进行抗原/抗体反应抗体反应,这样两者这样两者 的结合体就能通过抗体的荧光观察到。的结合体就能通过抗体的荧光观察到。 荧光的吸收光谱和发射光谱大致对称于某 轴分布,形成镜象关系 荧光发出时不像普通光那样会产生热效应, 它是冷光。 30-180nm 荧光发光方向与激发光的方向无关, 它呈球 体辐射 。 荧光具有偏振性。 原理: 荧光显微镜是利用一个高发光效率的 点光源,经过滤色系统发出一定波长的光作 为激发光、激发标本内的荧光物质发射出 各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜 的放大进行观察。 在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱 也易辨认,敏感性高，主要用于细胞结构和 功能以及

4、化学成分等的研究。 荧光显微镜的光源所起的作用不是直接 照明,而是作为一种激发标本的内荧光物质 的能源。我们之所以能观察标本,不是由于 光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激 发的光能后所呈现的荧光现象。 荧光显微镜的基本构造 : 由普通光学显微镜加上一些附件(如荧 光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断 滤片等)的基础上组成的。 荧光: 一般采用超高压汞灯(50-200W),它可 发出各种波长的光,但每种荧光物质都有一 个产生最强荧光的激发光波长，所以需加 用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和 绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光 透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。 光源光源 激发滤光片:紧

5、靠光源 UV:340-380nm 有色玻璃 V:390-460nm 种类: B:460-500nm 干涉滤色片 G:500-570nm 截止滤光片：物镜与目镜间 阻断(或压制)滤光片: 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧 光和损伤眼睛。 选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧 光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 1 透射式荧光显微镜 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料 来激发荧光的。常用暗视野集光器,也可用 普通集光器,调节反光镜使激发光转射和旁 射到标本上这是比较旧式的荧光显微镜。 其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放 大倍数增加其荧光减弱所以对观察较大 的标本材料较好。 优点优点: 由于

6、用了暗场聚光镜由于用了暗场聚光镜,激发光不能进入物镜激发光不能进入物镜, 因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于由于上述同样的原因，任何物镜都可用于 观察。观察。 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。 缺点缺点: 必须正确调整聚光镜中心和高度必须正确调整聚光镜中心和高度,否则不能否则不能 获得明亮的荧光像。获得明亮的荧光像。 由于暗视场聚光镜焦距限制由于暗视场聚光镜焦距限制,不能使用厚的不能使用厚的 载玻片。载玻片。 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标视场照明区不能过大，否则容易使

7、荧光标 本荧光色衰褪。本荧光色衰褪。 厚的或不透明的标本不适用。厚的或不透明的标本不适用。 2落射式荧光显微镜: 这是近代发展起来的新式荧光显微镜,与上 不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即用 同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光 路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度 角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上， 样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片 表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束 分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被 阻断滤片吸收。 光源光源:高压汞灯或卤素灯。高压汞灯或卤素灯。 聚光镜聚光镜:因为物镜作为聚光镜因为物镜作为聚光镜,所以不需要聚所以不

8、需要聚 光镜。光镜。 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外 光光,而且本身不产生荧光，对数值孔径没有而且本身不产生荧光，对数值孔径没有 限制。限制。 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。 荧光显微镜下的丝状细菌荧光显微镜下的丝状细菌 优点优点: 由于物镜兼作聚光镜由于物镜兼作聚光镜,不需要很多调节。不需要很多调节。 物镜数值孔径不受限制物镜数值孔径不受限制,在高放大倍率时，也可以在高放大倍率时，也可以 获得高分辨率的像。获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片

9、也能 使用。使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相 差法和透射微分干涉差法相结合。差法和透射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。可以避免不必要的荧光色衰褪现象。 缺点缺点: 在用低倍率物镜时在用低倍率物镜时,像比较暗像比较暗,因此必须用大因此必须用大 数值孔径的物镜。数值孔径的物镜。 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧 光。光。 激发荧光的方式: 按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外 线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。 UV激发法是用短于400nm的近紫外光进 行激发。该法不

10、存在可见的激发光,所以被观 察的荧光呈现该染料固有的荧光,容易判别标 本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。 BV激发法是以404nm、434nm为中心 的由紫外至蓝光进行激发。 该方法使用蓝光照射标本,所以荧光观 察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断 蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光 片。 用于荧光抗体法的荧光色素,对于激发 光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长 比较接近,所以BV激发法使用的滤光片必须 使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为 激发光，所以荧光色素的吸收效率较高， 可得到较明亮的图像。 其缺点是500nm以下的荧光无法看到, 而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧 光抗体法

11、中,大多以荧光色素特有的颜色来 判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性 时，上述BV激发法的缺点往往影响极大。 荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造 和激发光的波长按以下三点考虑: 从荧光像的反差要求来看,UV激发暗 场聚光器照明最好。 以像的亮度来考虑,BV激发滤光片暗 场观察效率最高。 UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗 场聚光器照明的特性,可看作介于这两种照 明方法之间,但前者滤光片暗场的性质较强， 显示图像较明亮，反差小;后者因保留暗场 光路的性质，故显示图像较暗，而反差有 所改善。当实际使用荧光显微镜时，应采 用最适合标本要求的照明法进行观察。 需要注意,即使像反差最佳的UV激发暗 场聚

12、光器照明,由标本折射或散射的部分紫 外激发光也会进入物镜，这样在光学系统 中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激发引 起的自身荧光会使像的反应变坏。因此， 必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片作为 截止滤光片（萤石或氟石玻璃）。 1使用显微镜时请保持周围环境的清 洁。 2打开灯源,超高压汞灯要预热几分 钟才能达到最亮点。使用荧光进行观察时, 不要频繁的开关荧光电源。开关间断时间 要保持在2030分钟以上。 3透射式荧光显微镜需在灯源与聚光 器之间装上所要求的激发滤片,在物镜的后 面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微 镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤 片双色束分离器阻断滤片的插块。 4仪器的所有镜头均

13、经校正,不得擅自 拆开,如有灰尘沾在镜头上可先用吹风球将 灰尘吹去，再用毛笔拂除。 载物台在不使用时不应放置过重 的物体，以防止升降机构损坏。 用低倍镜观察,根据不同型号荧光显微镜 的调节装置,调整光源中心，使其位于整个照明光 斑的中央。 放置标本片，调焦后即可观察。 使用中 应注意:未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起 眼的损伤;用油镜观察标本时，必须用无荧光的特 殊油镜;高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经 5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿 命。 显微镜使用过后,应立即切断电源。 并保持载物台的清洁。如使用100X油镜,请 在使用后，用清洁液清洗。 清洁液配比，乙醚:酒精=7:

14、3 观察荧光: 在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光 滤光片,可见经0.01的丫啶橙荧光染料染 色的细胞,细胞核和细胞质被激发产生两种 不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色) 严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进 行操作,不要随意改变程序。 应在暗室中进行检查,进人暗室后接通高 压稳压器电源，开启35min后再开启激发高压汞 灯，当看到高压汞灯完全亮后，停止激发，再开 始观察标本。 防止紫外线对眼睛的损害，做实验前将 防护屏放下。 检查时间每次以1h为宜,超过90min,高 压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本经激 发15min后，荧光亦明显减弱。 荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命 有限，标本应集中检查，节省时间;汞灯应避免多 次开启，最好避免在半小时内开关。 标本染色后立刻观察,因存放时间太久, 荧光会逐渐猝灭。可将染好色的标本用黑纸包好， 存放在聚乙烯塑料