普通组织化学PPT学习教案

1、会计学1 普通组织化学普通组织化学 组织化学源于组织学、细胞学和组织化学源于组织学、细胞学和 生物化学，又有别于这些学科。生物化学，又有别于这些学科。 组织化学与组织学和细胞学的不组织化学与组织学和细胞学的不 同在于，同在于，组织学和细胞学组织学和细胞学的着眼点的着眼点 是研究是研究组织和细胞形态结构；组织和细胞形态结构； 而组织化学的着眼点是研究组织而组织化学的着眼点是研究组织 和细胞内的和细胞内的化学组成及其含量化学组成及其含量； 第1页/共65页 生物化学技术生物化学技术中通常是将组织和中通常是将组织和 细胞破坏制成均浆，然后进行化学细胞破坏制成均浆，然后进行化学 沉淀，故其定位性能差；

2、沉淀，故其定位性能差； 而而组织化学技术组织化学技术中是尽可能在组中是尽可能在组 织或细胞内原位显示各种化学成分织或细胞内原位显示各种化学成分 ，故定位性能好。，故定位性能好。 生物化学技术中的化学反应是在生物化学技术中的化学反应是在 试管内试管内进行的，而组织化学技术中进行的，而组织化学技术中 的化学反应通常是在的化学反应通常是在组织切片或涂组织切片或涂 片片中进行的。中进行的。 第2页/共65页 组织化学在显微镜下能看到所组织化学在显微镜下能看到所 要检查的化学物质。要检查的化学物质。 所看到的不是某种化学物质本所看到的不是某种化学物质本 身，而是该物质在其存在的部身，而是该物质在其存在的

3、部 位经过化学反应后看得见反应位经过化学反应后看得见反应 产物。产物。 这种产物所在的位置和数量能这种产物所在的位置和数量能 够代表该物质的位置和数量。够代表该物质的位置和数量。 第3页/共65页 组织化学的基本原理是在组织组织化学的基本原理是在组织 切片或细胞内的拟检成分起化学反切片或细胞内的拟检成分起化学反 应。形成有颜色的终末反应产物，应。形成有颜色的终末反应产物， 该产物沉淀在相应成分所在的位置该产物沉淀在相应成分所在的位置 上，用以研究糖类上，用以研究糖类.脂类脂类.蛋白质蛋白质.酶类酶类 和核酸等物质在组织或细胞内的分和核酸等物质在组织或细胞内的分 布含量。布含量。 第4页/共65

4、页 在组织切片或涂片上显示在组织切片或涂片上显示不同不同 的化学物质，需要采用不同的组织的化学物质，需要采用不同的组织 化学处理程序化学处理程序. 就是应用某类方法处理之后所就是应用某类方法处理之后所 显示出的反应产物，只能代表相应显示出的反应产物，只能代表相应 的某类物质而不能代表其他。的某类物质而不能代表其他。 第5页/共65页 原理：化学试剂原理：化学试剂+ +化学物质化学物质- -变成变成有色反应产物有色反应产物 第6页/共65页 第7页/共65页 TX 第二节第二节 细胞和组织化学的基本细胞和组织化学的基本 技术技术 在应用在应用 组织化学技术显示组织和细组织化学技术显示组织和细 胞

5、内化学物质及定位和定量以及代谢胞内化学物质及定位和定量以及代谢 状态时，需要满足以下要求：状态时，需要满足以下要求： 1、保持组织和细胞形态结构的、保持组织和细胞形态结构的 良好状态，以便反应产物的定位精确。如良好状态，以便反应产物的定位精确。如 果形态结构破坏而失真，则定位困难。果形态结构破坏而失真，则定位困难。 第8页/共65页 （一）（一） 2、具备一定的特异性，以便获取、具备一定的特异性，以便获取 正确的实验结果。正确的实验结果。 （ 3、具备一定的灵敏性，以便含量极、具备一定的灵敏性，以便含量极 微的物质也能被显示出来。微的物质也能被显示出来。 第9页/共65页 （4 4、生成的反应

6、产物必须是有色沉淀、生成的反应产物必须是有色沉淀 ，颗粒微细不溶，定位于原位。反应物沉，颗粒微细不溶，定位于原位。反应物沉 淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性 具有一定的量效关系。具有一定的量效关系。 （、（、 5、反应产物具有稳定性，以便于重、反应产物具有稳定性，以便于重 复观察复观察 （、（、 6、要有重复性。、要有重复性。 第10页/共65页 第11页/共65页 4、股动物放血、股动物放血 将动物麻醉，切将动物麻醉，切 开股动脉放血。开股动脉放血。 第12页/共65页 第13页/共65页 第14页/共65页 第15页/共65页 第16页/共65页 固

7、定时间、固定温度都应考虑。固定时间、固定温度都应考虑。 第17页/共65页 第18页/共65页 第19页/共65页 第20页/共65页 第21页/共65页 第22页/共65页 第23页/共65页 第24页/共65页 第25页/共65页 2、按作用分类、按作用分类 第26页/共65页 凝固性固定剂作用:于溶胶状的蛋白 质，使其发生凝固并呈海绵状，在石蜡 包埋时利于溶化的石蜡的浸入，但易使 细胞器特别是线粒体受到破坏和形态改 变。 非凝固性固定剂的作用:是增加溶胶 状蛋白质的粘度，进而使细胞器变成不溶 性凝胶状态。这种固定剂对细胞器的结构 保持较好，但对包埋剂的浸透增强了阻力 。 第27页/共65

8、页 4）、固定液的选择）、固定液的选择 1、糖：组织细胞中最常见的多 糖是糖原和粘液物质。冷饱和苦味 酸的纯酒精溶液加甲醛（9：1）及 冷carnoy液，被广泛采用。 2、脂类：除含有脂溶剂的固定剂 外，其他的固定液均可应用。常用的 是甲醛 。 第28页/共65页 3 3、核酸：、核酸： 凝固性固定剂。如乙醇和醋凝固性固定剂。如乙醇和醋 酸 等 。 能 有 效 地 保 持 核 酸 ，酸 等 。 能 有 效 地 保 持 核 酸 ， carnoycarnoy固定液最为常用，但不宜固定液最为常用，但不宜 时间过长。酸性固定液中固定过时间过长。酸性固定液中固定过 久，会发生核酸和脱氧核糖核酸久，会发生

9、核酸和脱氧核糖核酸 被抽提出来。被抽提出来。 第29页/共65页 4 4、酶：、酶： 在酶组织化学技术中，为了增强酶在酶组织化学技术中，为了增强酶 反应的敏感性，必须高效地保存酶活反应的敏感性，必须高效地保存酶活 性。而为了正确判断反应结果，则必性。而为了正确判断反应结果，则必 须使酶反应能在原位进行。须使酶反应能在原位进行。丙酮和乙丙酮和乙 醇在很大程度上能使酶的反应在原位醇在很大程度上能使酶的反应在原位 进行不会发生反应产物的扩散。进行不会发生反应产物的扩散。冷丙冷丙 酮和冷乙醇最好。酮和冷乙醇最好。经甲醛（固定经甲醛（固定24h24h ）固定。碱性和酸性磷酸酶的活性也）固定。碱性和酸性磷

10、酸酶的活性也 保持较好。保持较好。 第30页/共65页 （一）石蜡切片法（一）石蜡切片法： 石蜡切片就是组织经固定、脱石蜡切片就是组织经固定、脱 水后包埋在石蜡内，再切成组织切水后包埋在石蜡内，再切成组织切 片可用来显示蛋白质、氨基酸、核片可用来显示蛋白质、氨基酸、核 酸和多糖等。酸和多糖等。 1. 1. 脱水：乙醇取代组织内的脱水：乙醇取代组织内的 水分，从水分，从50%50%低浓度乙醇开始。低浓度乙醇开始。 第31页/共65页 第32页/共65页 2. 2. 透明：二甲苯取代组织内的乙醇透明：二甲苯取代组织内的乙醇 3. 3. 浸蜡与包埋：石蜡取代组织内的浸蜡与包埋：石蜡取代组织内的 二甲

11、苯二甲苯（软蜡：（软蜡：454550 50 ；硬蜡：；硬蜡：55556060） 4. 4. 切片：切片：4 4 10m10m 5. 5. 展片与粘片：将切下的组织蜡片展片与粘片：将切下的组织蜡片 放放 入盛有入盛有40 40 左右温水的水槽中，左右温水的水槽中， 切片漂浮于水面并因受热而展开。蜡片切片漂浮于水面并因受热而展开。蜡片 即粘于载玻片上，置入即粘于载玻片上，置入37 37 烤箱内烤烤箱内烤 干以备反应显色。干以备反应显色。 第33页/共65页 （二）与冰冻有关的切片法（二）与冰冻有关的切片法 石蜡切片过程较复杂且浸蜡过石蜡切片过程较复杂且浸蜡过 程中的温度较高，易引起组织细胞程中的温

12、度较高，易引起组织细胞 内酶活性降低以及丧失和其它被检内酶活性降低以及丧失和其它被检 成分丢失。使组织化学反应性降低成分丢失。使组织化学反应性降低 。为了克服这个缺点，获得理想的。为了克服这个缺点，获得理想的 反应结果，通常采用与冰冻有关的反应结果，通常采用与冰冻有关的 制片技术，包括冰冻切片法、冰冻制片技术，包括冰冻切片法、冰冻 干燥法和冰冻替代法干燥法和冰冻替代法 第34页/共65页 1 1、冰冻切片法：冰冻切片法： 恒冷箱切片，一般可切出恒冷箱切片，一般可切出 3 350m50m厚的切片。大部分组厚的切片。大部分组 织在织在 -15 -15 -20-20度条件下切片度条件下切片 最易成功

13、。组织块温度过低，最易成功。组织块温度过低， 切片易碎。组织块温度或防卷切片易碎。组织块温度或防卷 夹温度高，切片会因组织潮湿夹温度高，切片会因组织潮湿 致粘附在切片刀上。致粘附在切片刀上。 第35页/共65页 1. 2 2、冰冻替代法：、冰冻替代法： 即组织经骤冷后立即置于低温即组织经骤冷后立即置于低温 （ （-40-40-70-70度）液体脱水剂。如丙酮中度）液体脱水剂。如丙酮中 ，使组织中的水被脱水剂替代，从而既，使组织中的水被脱水剂替代，从而既 起到组织脱水作用。可起到组织固定作起到组织脱水作用。可起到组织固定作 用。组织替代脱水后逐渐恢复到室温，用。组织替代脱水后逐渐恢复到室温， 再

14、进行石蜡包埋。再进行石蜡包埋。 此法多用于水解酶。氧化酶和脱此法多用于水解酶。氧化酶和脱 氧酶等的组织化学研究。氧酶等的组织化学研究。 第36页/共65页 第37页/共65页 第38页/共65页 第39页/共65页 第40页/共65页 第41页/共65页 第42页/共65页 第43页/共65页 绿色，派若宁与核仁及胞质内的 RNA结合呈红色。 第44页/共65页 第45页/共65页 第46页/共65页 第47页/共65页 第48页/共65页 第五节第五节显示多糖的高碘酸显示多糖的高碘酸Schiff(PAS)反应反应 1、反应原理：、反应原理： 高碘酸是一种强氧化剂，通过高碘酸 的氧化作用，打开

15、糖分子结构内乙二醇 中的碳-碳（CC）键形成醛基： 第49页/共65页 H OH H O OH H 高碘酸 O H C - C - - C C - 第50页/共65页 形成的醛基与Schiff试剂中无色的亚硫 酸品红起反应，生成紫红色化合物沉淀，有 此沉淀物的部位即表示有多糖的存在。 高碘酸 Schiff 多糖多糖 形成醛基 生成紫红色沉 淀 氧化 无色 第51页/共65页 （1）Schiff试剂的配制试剂的配制 改良法 1）配方: 碱性品红 1g 偏重亚硫酸钠(Na2S2O5) 2g 浓盐酸 2ml 蒸馏水 200ml 活性碳 0.3g 第52页/共65页 2) 2） 配法: 将颗粒状的碱性

16、品红研磨成细粉状以便溶 解 将蒸馏水煮沸，移开酒精灯冷至700C时将 碱 性品红加入，充分摇动，再让其冷至室温 ； 加入浓盐酸，充分混匀； 加入偏重亚硫酸钠，摇动至充分混匀，避 光 静置24h; 加入活性碳，摇动2min,过滤应如水般清亮 ，无色或微黄色。此滤液即为Schiff试剂 ， 且可立即使用。 第53页/共65页 注：Schiff试剂若暂时储存应将其置于棕色瓶 内，并将瓶盛满，不留或少留空间，且 用玻璃塞塞紧，以防SO2 跑掉。置冰箱 内保存备用。 第54页/共65页 （2）Graumaun标准法 1）配方： 碱性品红或对品红 0.5g 1N盐酸 15ml 偏重亚硫酸钠 0.5g 蒸馏

17、水 85ml 活性碳 0.3g 第55页/共65页 2 )配法: 将碱性品红或对品红溶于1N盐酸中; 将偏重亚硫酸钠溶于蒸馏水中; 将液立即加到液中去,充分混匀,但 不 要摇荡,入紧塞的棕色玻瓶中静置,随后, 其 红色渐变成浅黄色,静置24h; 加入活性碳,摇动2min并过滤,滤液即为 Schiff试剂,也应如水般清亮. 第56页/共65页 注: a、 注： a、此中Schiff试剂在满装紧塞的棕色玻 瓶内可保存数月； b、 b、用更强的还原剂，即保险粉Na2S2O5 替代偏重亚硫酸钠。在工作过程中，若Schiff 试剂泛红，可随意加入极少量的保险粉能立 即消除其红色。 第57页/共65页 （3)、0.5%高碘酸溶液的配制 高碘酸 0.5g 蒸馏水 100ml 将高碘酸溶入蒸馏水内即可. (4)、唾液的收集 收集唾液,用2-3