遗传性牙本质疾病致病基因突变谱的生物信息学研究

1、遗传性牙本质疾病致病基因突变谱的生物信息学研究 遗传性牙本质疾病致病基因突变谱的生物信息学研究#*51015摘要：为了对遗传性牙本质疾病致病基因 牙本质涎磷蛋白基因 突变谱进行总结和生物信息学分析。在 MEDLINE（以“DSPP”和“Mutation”为关键词进行检索分析。并运用 PolyPhen-2、SignalP 3.0、SplicePort等多种生物信息学软件对发现的突变进行分析。 结果发现世界上不同科研团队已经在 59个患者家系中报道了 40 个突变。其中 19 个错义突变或无义突变发生在 DSP 结构域，而 21个移码突变发生在 DPP 结构域。在 DSP 结构域中，1 个突变可能

2、改变信号肽剪切位置；4个突变降低信号肽剪切的可能性；10 个突变干扰外显子间的剪接；1 个突变提前终止翻译过程；还有 3 个突变可能对多肽的空间结构产生影响。此外，在 DPP 结构域的移码突变由于缺乏合适的分析软件，尚无法准确评估各个突变发生后的生物学效应。总之，通过生物信息学软件分析，本文对 DSPP 基因突变的生物学功能发掘了多项研究线索，后续研究应着力阐明生物信息学分析发现的多种假设，并紧密联系 DSPP 突变与疾病发生的分子机制。关键词：遗传性牙本质疾病；牙本质涎磷蛋白；突变；生物信息学中图分类号：R394.320Bioinformatic study of the spectrum

3、of mutations forhereditary dentin defectsHUANG Fumeng, LI Hairui, WANG Biyuan, MA Jie Department of Genetics and Molecular Biology, Xian Jiaotong University School of Medicine,25303540Shaanxi,Xian 710061 Abstract: To summary the spectrum of mutations in DSPP gene for hereditary dentin defects andper

4、form the bioinformatic analysis. The studies included in this summary were identified usingMedline and China Knowledge Resource Integrated Database with the search terms “DSPP” and“Mutation”. All of the data analyzed had been previously published. To investigate whether orhow the mutations may affec

5、t the function of DSPP, we used various bioinformatics softwareprograms PolyPhen-2, SignalP 3.0 and SplicePort . 59 independent families were found from 26different studies that identified 40 mutations within DSPP for the hereditary dentin defects. The 19missense or nonsense mutations were located w

6、ithin the DSP domain, and 21 mutations located inthe DPP domain cause frameshift mutations. In DSP domain, a mutation may change the cleavagesite for the signal peptide; four mutations may affect signal peptide cleavage; ten mutations mayaffect normal pre-mRNA splicing; a mutation can create a stop

7、codon; three mutatuons maydirectly affect the biological function of DSP by changing its normal space conformation.Unfortunately, bioinformatic analyses were unavailable for the frameshift mutations within theDPP domain. Overall, the present study have identified several clues for future studies usi

8、ngbioinformatic analysis. Further research is needed to clarify the hypotheses from the results of ourbioinformatic analyses, and to relate this to the molecular mechanisms by which DSPP mutationscause hereditary dentin defects.Key words: hereditary dentin defects; dentin sialophosphoprotein; mutati

9、on; bioinformatic-1-455055606570750 引言遗传性牙本质疾病是一类常染色体显性遗传疾病。一般根据临床表现可分为牙本质发育不全（dentinogenesis imperfecta, DGI）和牙本质发育异常（dentin dysplasia, DD）两类。DGI可细分为三种亚型，即：DGI-I（OMIM 166240）；DGI-II（OMIM 125490）；和DGI-III（OMIM125500）。而DD可分为两种亚型：DD-I（OMIM 125400）和 DD-II（OMIM 125420）1。各种牙本质疾病亚型的临床表现如下：DGI-I：伴有全身骨骼发育不全

10、的牙本质发育不全症。是一种全身性的结缔组织遗传性疾病，病变累及骨骼、牙本质、巩膜、耳及皮肤、血管等组织，其病因为广泛的 I 型胶原基因突变。DGI-II：又名遗传性乳光牙本质，具有家族遗传性，子代发生率为 50，为独立发生的牙本质发育异常，患者的乳牙、恒牙均可受累，其病因与牙本质的矿化不良有关，无全身性骨骼发育不良，在其家族成员中也检查不出骨发育不良的特征。DGI-III：是一种特殊的遗传性乳光牙本质，无成骨不全表现，其病因与牙齿矿化不良相关。其乳牙牙冠钝圆球形，棕黄色，恒牙形态小，排列稀疏，釉质磨耗，全口牙位曲面体层片示髓室根管宽大，牙本质薄，呈壳状。DD-I：在临床上大多数病例中恒牙和乳牙

11、的牙冠都有正常的形状，排列和颜色，但是放射性观察发现在恒牙中，牙根变短，牙髓是新月形的，和釉-牙骨质界平行，在乳牙中整个牙髓闭塞。在非龋齿中通常根尖周可透性通常会增加。DD-II：这种表现型的乳牙表现为DGI-的特点。大多数病例中恒牙有正常的形状，排列和颜色，恒牙的牙髓腔表现为多刺状管形，通常可见到髓石。牙根长度是正常的，观察不到频繁的根尖周的可透性。在一些病例中，可以观察到DGI-的特性，比如像球状冠，轻度变色和牙髓闭塞2。研究发现与牙本质发育密切相关的5个基因, 即: 牙本质涎磷蛋白基因（DSPP），牙本质基质蛋白1基因（DMP1），整合素结合的唾液酸蛋白基因（IBSP），细胞外基质磷酸化

12、糖蛋白基因（MEPE），分泌型磷酸蛋白1基因（SPP1）或骨桥蛋白基因（OPN）均位于人类染色体4q区域。有趣的是在已知的遗传性牙本质疾病中, 所有致病突变均发生在DSPP基因上,尚未在其他4个基因上发现任何突变报道2。目前已知DSPP基因位于染色体4q22.1区域，含5个外显子, cDNA全长约8,350bp，翻译产物为一条由1,253个氨基酸残基组成的多肽链。前期研究发现DSPP经牙本质细胞合成后，即被骨形态发生蛋白1 BMP1 分解为牙本质唾液酸蛋白（DSP）和牙本质磷酸蛋白（DPP）两条肽链3。DSP结构域由外显子1-4和外显子5的部分氨基酸残基组成，而近C端的外显子5的其余氨基酸残基

13、组成DPP结构域。此外，在N端的15个氨基酸残基共同构成信号肽序列。近来的研究发现在DSP和DPP之间还存在牙本质糖蛋白（DGP）结构域 位于DSPP外显子5 4（图1）-2-8085图 1 DSPP 基因结构示意图Fig.1 The structure of DSPP gene基于上述研究现状，此项研究对国内外所有正式发表的 DSPP 基因突变的研究报道进行了收集和汇总，同时运用不同的生物信息学软件对已知的这些突变进行进一步的分析和预测，以期为后续的研究提供新的研究思路和线索。1 材料与方法1.1数据收集为收集所有报道 DSPP 基因突变的研究文献，在 MEDLINE（和中国期刊网（90对于

14、检索到的文献，首先审阅摘要以初步评估该文献是否涉及 DSPP 基因及突变。其次，对文献全文阅读以确定是否为首次发表的突变报道。第三，对文献中涉及的参考文献根据研究需要进一步跟踪以避免遗漏重要的首发突变报道。最后,对最终入选的文献报道,根据突变位点所在染色体位置的先后顺序进行排序和分类统计。951.2DSPP 基因突变谱DSPP 基因突变谱 根据上述统计结果绘制 DSPP 基因突变谱, 并注明突变位点所在基因内位置、cDNA 内位置、突变前后的氨基酸残基变化、对应的疾病类型、以及突变发生的人群等信息。1.3突变的生物学效应分析运用软件 PolyPhen-2 分析突变对翻译产物结构和100105功

15、能的影响；运用软件软件 SignalP 3.0 的分析突变对信号肽剪切位置的影响；运用软件 SplicePort 分析突变对外显子之间的剪接的影响。2 结果经过严格的筛选，结果发现截止 2012 年 8 月 31 日，国内外首次报道 DSPP 基因突变的原创性论文共计 26 篇5-30，累计在 59 个不同人群的家系中发现了 40 种不同的突变。其中19 种错义或无义突变均发生在 DSP 结构域5-25，而 21 种移码突变均发生在 DPP 结构域9,26-30于移码突变的分析，因此，对 DSP 和 DPP 结构域中的突变分别进行了统计和分析。-3-1102.1DSP 结构域突变谱在 DSP

16、结构域的外显子 2 中发现突变 5 种（c.16T G、c.44C T、c.49C A、c.49C T、c.50C T），其中 c.16T G（p.Y6D）位于信号肽序列内部，c.44C T（p.A15V）位于信号剪切位置，而 c.49C A（p.P17T）、c.49C T（p.P17S）、c.50C T（p.P17L）均紧邻信号肽剪切位置。内含子 2 区域发现突变 4 种（c.52-25del23bp、c.52-6T G、c.52-3C G、c.52-3C A），这些突变均位于外显子 2 起点 c.52 上游。外显子 3 区域发现突变 3 种（c.52G T、c.53T A、115c.133

17、C T），c.52G T p.V18F 和 c.53T A p.V18D 位于外显子 2 上游末端，靠近与内含子 2的衔接处，而 c.133C T p.V18_Q45del 为一个终止密码子，引起翻译的提前终止。内含子 3区域发现突变 4 种（c.135+1G A、c.135+1G T、c.135+2T C、c.135+3 A G），它们的位置均靠近外显子 3 的下游末端（c.135）。外显子 4 内发现突变 3 种（c.202A T、c.612T G、c.625A T），均位于肽链内部，远离与内含子的衔接处（表 1）。120表 1 DSP 结构域突变谱Tab. 1 The spectrum

18、of mutations for DSP domain文献报道Rajpar et al. 2002 5Malmgren et al. 2004 6Xiao et al. 2001 7Zhang et al. 2007 8;位置Exon 2cDNAc.16T Gc.44C Tc.49C Ac.49C T蛋白质p.Y6Dp.A15Vp.P17Tp.P17S表型DD-IIDGI-IIDGI-IIDGI-II国别和人群 a德国美国中国中国Mcknight et al. 2008a 9Qu et al. 2009 10高加索中国Li et al. 2012 11c.50C Tp.P17LDGI-II中国

19、Wang et al. 2009 12Intron 2c.52-25del23bpDGI-II中国 IVS2-3C A Lee et al. 2008 13Kim et al. 2004 14Holappa et al. 2006 15c.52-6T Gc.52-3C Gc.52-3C ADD-IIDGI-IIDGI-II韩国韩国芬兰Xiao et al. 2001 7;Exon 3c.52G Tp.V18FDGI-II/III中国Kim et al. 2005 16;Kim et al. 2005 16;Song et al. 2006 17;Holappa et al. 2006 15韩国

20、高加索中国芬兰Lee et al. 2009 19;c.53T Ap.V18DDGI-II/III韩国Kida et al. 2009 19;Lee et al. 2011a 20日本韩国Zhang et al. 2001 21;Wu et al. 2004 22c.133C Tp.V18_Q45del p.Q45X DGI-II中国中国Song et al. 2006 17中国Xiao et al. 2001 7Mcknight et al. 2008a 9Zhang et al. 2011 23Bai et al. 2010 24Intron 3c.135+1G Ac.135+1G Tc.

21、135+2T Cc.135+3 A GDGI-IIDGI-II/IIIDGI-IIDGI-II中国高加索中国中国 IVS3+3A G Malmgren et al. 2004 6;Exon 4c.202A Tp.R68WDGI-II美国Holappa et al. 2006 15芬兰Yang et al. 2006 25ac.612T Gp.C204WDGI-II中国-4-Yang et al. 2006 25ac.625A Tp.N209YDGI-II中国aYang 杨帆 等人的研究中对突变位置的定位不符合现行的标准，因此，本研究中重新进行了定位。1252.2DSP 结构域突变的生物学效应P

22、olyPhen-2 软件对 11 种外显子区域突变的分析显示，除 c.133C T p.V18_Q45del 为提前终止翻译，不适用于软件分析外，其余 10 种突变的评价分值均 0.950 风险程度范围为 0-1，分值越大，破坏性程度越高 。表明上述 10 种突变对蛋白质的功能均产生破坏性影响，而c.133C T p.V18_Q45del 能够提前终止翻译，理论上可将对蛋白质产物的功能降为零。因此，130135140145150在外显子区域的 11 种突变均对蛋白质的功能产生破坏性的作用。SignalP 3.0 软件对这 11 种非同义突变的分析显示，5 种突变 c.16T G p.Y6D 、

23、c.44C T p.A15V 、c.49C A p.P17T 、c.49C T p.P17S 和 c.50C T p.P17L 可使正常信号肽剪切评价分值（0.946）产生较大下降，至 0.764 以下（分值范围为 0-1，分值下降越多，负面影响越大），其中 c.44C T p.A15V 位于信号肽剪切处，可能造成剪切位点的改变。其余 6 种突变 c.52G T p.V18F 、 c.53T A p.V18D 、 c.133C T p.V18_Q45del 、 c.202A T p.R68W 、c.612T G p.C204W 和 c.625A T p.N209Y 距离 p15 和 p16 位

24、间的信号肽剪切位置相对较远，对信号肽剪切几乎不产生影响，评价分值均大于 0.923。因此，这 6 种突变的负面生物学效应可能是通过其他方式来发挥作用的。事实上，后续的分析也证明了这一点。SplicePort 软件对外显子间剪接的分析发现，内含子 2 和 3 中的 8 种突变（c.52-25del23bp、c.52-6T G、c.52-3C G、c.52-3C A、c.135+1G A、c.135+1G T、c.135+2T C 和 c.135+3 A G），均可将正常剪接评分 0.9 降低为 0 分（分值范围为 0-1，分值下降越多，负面影响越大）。同时，位于外显子 3 上游的两个突变 c.5

25、2G T p.V18F 和 c.53T A p.V18D 同样可使正常剪接评分 0.9 降低为 0.482 分以下，表明它们同样是通过影响外显子剪接来发挥生物学效应的，这也与此两突变位于内含子 2 与外显子 3 衔接处的位置相对应。位于外显子 4 内部的 3 个突变 c.202A T p.R68W 、c.612T G p.C204W 和 c.625A T p.N209Y 均远离外显子剪接处，其分析结果也与外显子剪接无关。通过进一步的分析发现，c.202A T p.R68W 、c.612T G p.C204W 和 c.625A T p.N209Y 这 3 种突变，其突变前的正常氨基酸残基均不含苯

26、环结构，而突变后的氨基酸残基分别为色氨酸、色氨酸和酪氨酸均携带有苯环结构，因此，可认为此3 种突变可为新生肽链引入特殊的苯环结构，从而对蛋白质产物的空间结构产生影响，进一步影响其生物学功能。最后对 DSP 结构域的 19 种突变的生物学效应进行了细致的分类，如表 2 所示。表 2 DSP 结构域突变的生物学效应Tab. 2 The biological effect of mutations in DSP domain突变的生物学效应位置外显子 2信号肽剪切c.16T G p.Y6D 外显子剪接蛋白质空间结构c.44C T p.A15V c.49C A p.P17T c.49C T p.P17

27、S c.50C T p.P17L 内含子 2c.52-25del23bpc.52-6T Gc.52-3C G-5-外显子 3内含子 3外显子 4c.52-3C Ac.52G T p.V18F c.53T A p.V18D c.135+1G Ac.135+1G Tc.135+2T Cc.135+3 A Gc.133C T p.Q45X c.202A T p.R68W c.612T G p.C204W c.625A T p.N209Y 1552.3DPP 结构域突变谱DPP 结构域累计发现 21 种移码突变（插入或缺失），理论上它们对蛋白质结构的影响各不相同，鉴于迄今尚无合适的分析软件来评价这些突

28、变的生物学效应，因此，本研究仅对这些突变进行了收集和总结，如表 3。160表 3 DPP 结构域突变谱Tab. 3 The spectrum of mutations for DPP domain文献报道Nieminen et al. 2011 26Nieminen et al. 2011 26Mcknight et al. 2008a 9Mcknight et al. 2008a 9;cDNAc.1686delTc.1830delCc.1870-1873delTCAGc.1918-1921delTCAG蛋白质p.D562EfsX752p.S610RfsX704p.S624TfsX687p.S

29、640TfsX671表型DD-IIDD-IIDD-IIDD-II国别和人群 a芬兰芬兰高加索高加索Nieminen et al. 2011 26希腊*3Nieminen et al. 2011 26Song et al. 2008 27Nieminen et al. 2011 26Mcknight et al. 2008a 9Nieminen et al. 2011 26Mcknight et al. 2008a 9Song et al. 2008 27Nieminen et al. 2011 26Song et al. 2008 27Lee et al. 2011b 28Mcknight e

30、t al. 2008b 29Song et al. 2008 27Song et al. 2008 27c.1922-1925delACAGc.2040delCc.2063delAc.2272delAc.2349delTc.2525delGc.2593delAc.2666delGc.2684delGc.2688delTc.3141delCc.3438delCc.3546-3550p.D641AfsX672p.S680fsX1313p.D688VfsX626p.S758AfsX554p.S783RfsX531p.S842TfsX471p.S865fsX1313p.S889TfsX425p.S89

31、5fsX1313p.D1146fsX1313p.D1182fsX1312DD-IIDD-IIDD-IIDGI-II/IIIDGI-IIDGI-II/IIIDGI-IIDGI-IIDGI-IIDGI-IIDDDGI-IIDGI-II芬兰中国芬兰*2高加索西班牙高加索*4中国希腊中国韩国*2高加索中国中国delTAGCAinsGLee et al. 2011b 28c.3560delGDGI-II韩国Nieminen et al. 2011 26Dong et al. 2005 30c.3582-3591del10bpc.3599-3634del36bpp.D1194EfsX117Del1160-

32、1171DGI-IIDGI-III芬兰美国and c.3715-3716ins18bpand Ins1198-1199Nieminen et al. 2011 26c.3625-3700del76bpp.D1209AfsX80DGI-II越南a*N: 表示同一突变在 N 个不同的家系中被发现。-6-1651701751801853 讨论此项研究中，对发生在 DSPP 基因的突变进行了汇总和生物信息学分析。截止 2012 年8 月 31 日，国内外首次报道 DSPP 基因突变的原创性论文共计 26 篇5-30，累计在 59 个不同人群的家系中发现了 40 种不同的突变。其中 19 种错义或无义突

33、变均发生在 DSP 结构域5-25，而 21 种移码突变均发生在 DPP 结构域9,26-30。此外，未发现任何 DGP 结构域的突变报道。据笔者所知，迄今为止，这也是世界上最为全面的一项 DSPP 基因突变研究。通过生物信息学分析对 DSP 结构域突变有了新的认识，同时，发现了多项新的研究线索，即：突变 c.44C T p.A15V 可能改变信号肽剪切位置；突变 c.16T G p.Y6D 、c.49C A p.P17T 、 c.49C T p.P17S 和 c.50C T p.P17L 降 低 信 号 肽 剪 切 的 可 能 性 ； 突 变c.52-25del23bp、c.52-6T G、

34、c.52-3C G、c.52-3C A、c.52G T p.V18F 、c.53T A p.V18D 、c.135+1G A、c.135+1G T、c.135+2T C 和 c.135+3 A G 干扰外显子间的剪接；突变 c.133C T p.Q45X 提前终止翻译过程；还有突变 c.202A T p.R68W 、c.612T G p.C204W 和 c.625A T p.N209Y 可能对多肽的空间结构产生影响。这也为后续的研究工作指明了方向。事实上，此研究的分析结果与一些报道中的实验结果相吻合5,9,18,20。另一方面，尽管 DSPP 基因的全部序列已经测出，但是在不同的研究中 DPP

35、 结构域的序列各不相同，从而造成 DPP 结构域的野生型序列尚无法确定的现状，不得不说令人遗憾。此外，所有移码突变均集中与 DPP 结构域的现象，同样是一条引人注目的研究线索。最后，文献收集中还发现 Yang 等人25于 2006 年首次发现了 2 个新的 DSP 结构域突变c.612T G p.C204W 和 c.625A T p.N209Y 。但是由于他们的论文发表在了中文期刊上，结果未能被国外学者检索和阅读，最终该研究未在任何国际刊物上被引用。这也说明，在当前的科研工作中，积极参与国际竞争和交流的重要性。4 结论此项研究通过的 DSPP 基因遗传突变谱的总结和生物信息学分析，为今后的研究

36、工作发掘了多种线索，后续研究应着力阐明生物信息学分析发现的多种假设，并紧密联系 DSPP 突变与疾病发生的分子机制。190参考文献 References 1 Maciejewska I, Chomik E. Hereditary dentine disease resulting from mutations in DSPP gene J. J Dent, 2012,40 7 :542-548.2 Kim J W, Simmer JP. Hereditary dentin defects J. J Dent Res, 86 5 :392-399.1952002052103 Von M Z, F

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