微生物实验1-2

1、实验一 光学显微镜的结构和使用方法一、目的1.熟悉显微镜每一部件的结构和功能。2.掌握油镜的使用方法。3.观察细菌的基本形态。二、器材1.显微镜、香柏油、擦镜纸、纱布、洗耳球、毛刷、二甲苯或擦镜液。2.葡萄球菌、苏云金杆菌、枯草杆菌。三、显微镜的结构和功能显微镜是微生物研究中最重要的工具之一，但往往因缺乏有关显微镜光学系统，结构及操作方法等方面的知识，影响了显微镜实际使用的效果。因此，必须充分搞清显微镜中每一部件的结构和功能，熟练掌握它的使用方法，才可收到较好的效果。显微镜由光学和机械两部分组成。（一）光学部分1.物镜：物镜是显微镜上最重要的部件，由一组特殊的透镜组成，可以消除和校正球面象差和

2、色差。它的功能除了具有放大作用外，对于分辩率有着决定性的影响。光学显微镜一般配有3-4个物镜，5-10倍为低倍镜，20-25倍为中倍镜，40-60为高倍镜，这三个物镜与样品之间的介质为空气，称之为干燥系物镜。90-100倍是油镜，物镜与样品之间的介质是香柏油，称之为油浸系物镜，用HI或oil表示。（1）放大率（2）数值孔径数值孔径又称镜口率（numerical aperfure简写为N.A）在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，是决定它们性能的最重要指标。数值孔径可用下式表示n 表示样品与物镜之间介质的折光率。a 表示镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出光线与物镜前透镜之间的最大夹角（见

3、图2） 图1 物镜的各种标记 图2 物镜的镜口角（3）分辨率显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别细微结构的能力，也就是它能辨别接近的两点之间的最小距离。用符号D代表可分辩的两点之间的最小距离，用下式表示。图3 油浸的作用左为干燥系统透镜，右为油浸系统透镜由上式可知，要提高透镜的分辩率，一是缩短所用的波长（），二是增大数值孔径。光学显微镜一般都是使用可见光为光源，可见光的波长在0.4-0.8微米范围，平均波长为0.55微米，可视为常数。因此，数值孔径愈大，D值愈小，透镜的分辩率愈高。要增大数值孔径，就必须增大n和a的数值。而a最大值是180，所以的最大值是1，这事实上是不可能的。现在用的物镜最大的角

4、为67，sin67=0.93，当样品和透镜之间的介质是空气（）时，只为0.93。如果将样品和透镜之间的介质换成表1 物镜的焦距和工作距离物镜倍数物镜焦距（mm）物镜的工作距离（mm）10x168.345x40.73100x1.80.14与玻璃折光率相近的香柏油（），那末可提高到1.40，所以油镜的分辩率比低倍或高倍镜要高得多。例如，在可见光照明下，数值孔径为1.25油镜分辨出物体两点之间的最短距离为微米。而数值孔径为0.65的高倍镜，能分辨出物体两点之间的最短距离为微米。如两点之间的最小距离如果小于0.4微米，在高倍镜下即混为一点，不可分辨，而在油镜下则清晰可见。另外，在油镜和样品之间加入了一

5、种和玻璃相同折光率的香柏油，还能使光线通过玻片时边缘部分光的损失减少，增强视野的亮度。（见图3）。（4）物镜的焦距和工作距离不同放大率的物镜的焦距和工作距离（指物镜到玻片标本之间的距离）是不相同的，从表中可知，低倍物镜的焦距和工作距都比较长，而高倍物镜和油浸镜的工作距离极短，因此，在使用过程中应十分小心。（见图4和表1）图4 物镜的焦距和工作距离物镜的种类有消色差物镜、复消色差物镜、平面消色差物镜等。由于高倍物镜工作距离短，为了防止损坏物镜和样品，还装有弹簧缓冲器，有些较高级物镜还设有光圈。2.目镜：目镜由上下两块透镜组成。起着将经物镜放大的实象进一步放大的作用；也可校正物镜余留下来的色差和球

6、面象差。显微镜一般配有5倍、10倍、15倍、20倍数个目镜。目镜种类有惠更斯目镜，用“H”表示；平周目镜，用“P”表示；广视野目镜，标有“WF”符号。3显微镜总的放大率：显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积。可是。即使总放大率一样。由于物镜与目镜搭配不同，其分辨率也不同。如数值孔径大的40倍物镜和5倍的目镜相搭配其分辨率要比数值孔径小的10倍物镜和20倍目镜搭配高些。显微镜有效的总放大率随人们眼睛分辨率不同，一般为数值孔径的500-1000倍。因此，有时即使提高了目镜的放大率，成象反而模糊不清，分辨率也变得不好，称之为无效放大。因而，提高总的放大率应主要靠物镜，而不要指望目镜。4聚光

7、器：聚光器位于载物台的下方，因其作用不同，可分为明视野聚光器和暗视野聚光器两种。明视野聚光器由集光镜、虹彩光圈、滤光片架和调节螺旋组成。聚光器的作用除了将大量光线汇集成为一束强的光锥来增强标本的照明外，还可以提高物镜的分辨率，因物镜有效的数值孔径等于物镜的数值孔径加聚光器的数值孔径再除2，所以，在使用时原则上要求聚光器的数值孔径与物镜的数值孔径一致。聚光器上标的是最大的数值孔径，即是指开大虹彩光圈，聚光器升到顶时的数值孔径。若要降低聚光器的数值孔径，可适当的缩小虹彩光圈和降低聚光器来进行调节。滤光片架专为放置滤光片用。如强光照射时，可加毛玻璃片，使光线柔和均匀；在用聚光灯泡照明时，可装兰色滤光

8、片，可避免黄色光的干扰。5反光镜：位于显微镜最下方，由一面平面另一面凹面的镜子组成。其作用是将投射来的光线反射到聚光镜的中央，照明标本。平面镜在强光时使用；凹面镜则用于弱光或有障碍物时使用，高效能的显微镜往往附有专门的照明装置。（二)机械部分包括镜座、镜身、镜臂、镜筒、载物台、转换器及调节镜筒上下移动的粗细螺旋等部件，载物台上附有十字推进器或压夹。它们起了固定、支持、连续和移动调节的作用。四、显微镜使用方法（一）镜检前的准备1检查：每次使用显微镜前，应先检查显微镜各部件是否完好，安放或调节在规定的位置上，有无尘土。应做好必要的调整和清洁工作，准备好使用。2.对光：显微镜应放在位置前方实验桌偏左

9、侧，将凳子调到合适的高度后，先把低倍镜转至镜筒下方，调节粗螺旋使物镜头与载物台相距约3厘米左右，再将聚光镜调节到与载物台距离约l厘米，反光镜对准光源，然后一面观察，一面调节反光镜，直到全视野光线均匀，亮度适合。3根据作使用者的个人情况，双筒显微镜的目镜间距可适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的观察者。（二）低倍镜观察检查标本必须先用低倍镜观察，因低倍镜视野大，易发现目标和确定检查的位置。将玻片标本置于载物台上，要检查的部位对准聚光镜的中心，然后转动粗螺旋将镜头降落或载物台升高到距标本0.5厘米处，通过目镜一边观察，一边慢慢调节粗螺旋，直至物象出现，再仔

10、细调节焦距和光照，移动推进器，认真检查标本的各个部位，找到最适合的位置，移到视野中间，仔细观察并记录结果。（三）高倍镜观察将高倍镜转至镜筒下方，按照显微镜的设计条件，只要在低倍镜下已经找到了目的物，低倍镜可直接转换高倍镜。为了避免因低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞，故在转换物镜时，要从侧面注视。然后调节光线亮度适中，再仔细反复转动螺旋，获得清晰物象为止，将选择最满意的镜检部位移至视野中央，仔细观察并记录所观察的结果。（四）油镜观察细菌或其他标本的细微结构，都要用油镜观察。由于油镜的放大倍数高，工作距离仅在0.14毫米左右，故使用时必须特别小心，具体操作步骤如下：1用粗螺旋将镜筒提起约2厘米

11、，把油镜转到镜筒下方，再把聚光器升到顶，开大虹彩光圈，然后在镜头正下方的标本玻片上滴上一滴香柏油。2降落镜筒，使油镜头触到油滴，再稍降落，把镜头浸到油中，直到几乎与标本接触为止。在进行这一操作过程中，一定要十分小心，要从侧面注视油镜的下降，注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏镜头。3在目镜观察同时，慢慢转动粗螺旋，使镜筒徐徐上升，(注意此时只准上升镜筒不准下降)，当视野中有模糊的标本物象出现时，改用细调节螺旋直至物象清晰为止，再移动玻片，找到最合适的标本位置。4如果向上转动粗螺旋已使镜头离开油滴又末发现标本时，可重新按照上述步骤操作，直到看清目的物为止。5用油镜观察葡萄球菌和苏云金杆菌或枯

12、草杆菌的染色标本片五、显微镜的保养1使用油镜，用完后应把镜油头转向外侧，拿三小张擦镜纸。第一张擦去镜头上的香柏油，第二张沾少量二甲苯或擦镜液擦去残留在镜头上的油，第三张再擦去留在镜头上的二甲苯，使镜头不沾有油迹和二甲苯。2用完显微镜应擦净各部件，机械油漆部分可用纱布，抛光金属部分用绸布，镜片必须用擦镜纸。勿留任何油迹、灰尘、水气和手痕。3各部件归原为贮存状态(1)移动镜台，应把透视孔中心恢复到光轴。(2)把聚光器升到顶，打开虹彩光圈，把反光镜竖直。(3)将纱布和绸布折好放在载物台上，如果落到最低点而低倍物镜在中央碰不到镜台或聚光器，即可将低倍物镜固定在中央位置上，否则就要将两物镜转成八字的位置

13、，再把镜筒落下。 (4)十字推进器归原位最后套上黑布罩，放回镜箱。显微镜应放在阴凉干燥处，尽量避免直接在阳光下暴晒，不能和挥发性或易腐蚀性药品放在一起。霉雨季节在镜箱内应放硅胶(装在小布袋内)以吸水防潮，长时间不用时镜头应存放在干燥器内。实验二 细菌的染色方法和细菌细胞形态结构的观察一、目的 1了解生物染色的一般知识。 2学习细菌的涂片、染色的基本技术，并掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 3通过染色观察细菌细胞的形态和结构。二、染色的一般知识 细菌个体不仅微小，而且是无色半透明，在明视野微镜下很难看得清楚。因此，要借助各种不同的染色法，使细菌细胞或某些结构着色，与背景形成明显的反差。染色的

14、标本不仅在显微镜下易于观察，还有鉴别细菌不同的细胞结构的作用。(一)染料 染料通常分为两类，即天然染料和人工合成染料。人工合成染料又称为苯胺染料或煤焦油染料，也是目前人们用得最多的染料。 染料是指一类在苯环上连发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团给于该化合物以颜色的特性，含有发色基团的苯化合物被称为“色原”。色原虽然有色，但不能称为染料，因为它对纤维或组织没有亲合力，它虽可以使纤维或者组织涂上色，但经机械力作用后又易被除去。要使一种物质成为染料，除了应含有发色基团以外，还需要另一种能使化合物发生电离作用的辅助的基团，这叫做助色基团，它具有使化合物成盐的作用，可使被染物真正染上颜色。例如，硝

15、基(-N0)是一种发色基团，当苯环上的三个氢原子被三个硝基取代以后，得到三硝基苯，它是一种黄色的化合物，但是，三硝基苯不是一种染料，而是色原，因它不能电离，因此，也不能与被染物结合。当三硝基苯中的一个氢原子被助色基团羟基(-OH)代替，形成为三硝基酚，又称之为苦味酸，具有电离的特性，可与碱形成盐，所以，苦味酸是一种黄色染料。(二)酸性染料与碱性染料 酸性染料或碱性染料并不是指染料本身是属于酸还是属于碱，也不是指染色液的氢离子浓度。商店出售的染料一般都是为中性盐。酸性染料还是碱性染料是指染料电离以后，染色部分带负电荷为酸性染料，如果染色部分带的是正电荷，即为碱性染料。常用的酸性染料有刚果红、伊红

16、、黑素等，常用的碱性染料有结晶紫、石碳酸复红、品红、美兰、孔雀绿等。酸性染料主要染细胞质，碱性染料主要染核和异染粒等酸性成分。由于细菌细胞质内充满了核物质，因此，细菌染色常用碱性染料。(三)染色方法 1按菌体细胞或结构能否被染上颜色，可分为正染色法与负染色法。 正染色法：选择一种能与细胞相结合的染料，使菌体细胞染上一定的颜色，而背景颜色很快被流水冲洗掉，使菌体形态明显可见的染色方法，这也是一般观察形态时最常用的方法。 负染色法：选择一种与菌体细胞不能结合的染料菌体细胞染不上色。而背景染上一定的颜色，把菌体反衬出来的染色法。 2按使用染料种类分为单染色法、复染色法和鉴别染色法。 单染色法：在整个

17、染色过程中只使用一种染料染色的方法。 复染色法：用二种以上染料染色，有双重染色，三重染色等。鉴别染色法：某些染料或试剂与细菌细胞的某结构或成分发生特殊性染色反应。从而可以被识别，如革兰氏染色、抗酸染色等。三、细菌的简单染色法(一)器材 1显微镜、酒精灯、载玻片、镊子、接种耳、蒸馏水、香柏油、二甲苯、火柴、吸水纸、擦镜纸。 2结晶紫染色液或石碳酸复红染色液。(见附录二)3球菌、枯草杆菌等。(二)步骤 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检 1.涂片：用镊子取浸泡在酒精中干净的载玻片，烧去酒精，在玻片中央加一小滴蒸馏水(若是液体培养物可不加水)，通过无菌操作方法从斜面上挑取少量菌与玻片上的水滴混合，均匀地涂

18、布成直径约1平方厘米的涂面。 2.干燥：涂片可让其在室温下自然干燥，必要时可将涂面向上，小心地在酒精灯火焰高处稍烘，以助水分蒸发，快速干燥。但切勿靠近火焰，将标本烤焦。 3.固定：一般常采用加热固定法，即手持玻片的一端，涂面向上，在火焰外层通过3-4次(约2-3秒钟)，以玻片反面触及皮肤不觉得太烫为度。待冷却后，再进行染色。 固定的目的是杀死细菌，并尽可能保持细胞和结构的原来状态；改变菌体对染料的通透性，增强染色效果；使菌体牢固地粘附在玻片上，不易被水冲掉。 4.染色：待固定涂片完全冷却后，在涂面上滴加染色液，染色液要布满整个涂面。染色的时间因染料的着色能力和浓度不一样而有差异，石炭酸复红着色

19、力强，染20-30秒钟即可呈红色，结晶紫染1分钟呈紫色，蕃红、美兰则需染3-5分钟，分别呈红色和兰色。 5.水洗：染色时间到后，倾去染色液，斜置载玻片，用干净的细流水冲去多余的染料(冲洗时水流不能直接冲在涂面上)，直至冲下之水无色为止。 6.干燥：用吸水纸吸去玻片上的水分后，让其自然干燥或在火焰高处徐徐烘干，涂片染色过程见(图5)。 7.镜检：用油镜进行观察，并记录观察结果。图5 涂片染色过程示意图四、细菌的革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中一种重要的鉴别染色法。革兰氏染色可将细菌分成两大类，被染成紫色的细菌，称之为革兰氏染色阳性或正反应(用G+表示)；被染成红色的细菌，称之为革兰氏染色阴性或

20、负反应(用G-表示)(一)器材1显微镜等器具与简单染色法相同。2结晶紫染色液、碘液、95酒精、蕃红染色液。(见附录二)。3在牛肉膏蛋白胨斜面上培养18-24小时的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或枯草杆菌。(二)步骤涂片干燥固定结晶紫染色1分钟水洗(沥干水) 碘液媒染1分钟水洗(沥干水) 95酒精脱色20-30秒钟蕃红染色3分钟水洗干燥镜检。镜检 用油镜观察，并记录颜色和染色反应结果【注意事项】：1在一张载玻片上，分别涂大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两个涂面，涂面干燥，固定等方法与简单染色法相同。2染色过程中，染色和脱色的时间，碘液和酒精浓度，涂片的厚薄，菌龄等方面都会影响到革兰氏染色反应的结果，而酒精脱色

21、的时间是最关键的一步。五、细菌的芽孢染色法细菌的芽孢壁厚，通透性差，着色比较困难。用普通的方法染色时，菌体着色而芽孢呈现出不染色的轮廓。但是芽孢一旦染上颜色以后，脱色也较困难，根据这一特点，采用着色力强的孔雀绿或石碳酸复红染色液、并加热染色时，使菌体芽孢都着色，水洗脱去菌体颜色而保留芽孢的颜色。然后再用另一种染料复染菌体使菌体与芽孢被染成两种不同的颜色，更易区分。（一）器材15孔雀绿染色液、0.5蕃红染色液（见附录二)。2在牛肉膏蛋白胨斜面上一般培养2436小时的枯草杆菌或苏云金杆菌，蜡状芽孢杆菌，所用菌种掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢囊为宜。3其他用具同简单染色法。（二）步骤1挑取少量的枯

22、草杆菌或苏云金杆依次涂片、干燥、固定。2在涂布面上滴加5孔雀绿色液34滴，在酒精灯上微微加热至略有蒸汽产生，但勿使沸腾，并根据情况，可随时添加蒸馏水或染色液，不能使涂面蒸干，染色10分钟，冷却后用水冲洗干净，再用蕃红复染23分钟，水洗、晾干。3镜检：在油镜下观察，芽孢呈绿色，芽孢囊和营养体为红色。并注意观察芽孢的形状、大小和位置。六、细菌的荚膜染色荚膜是包围在某些细菌细胞外面的一层多糖的粘液性物质，对染料的亲和力很低，不易染色，常用负染色法将不易着色的荚膜衬托出来。另外，李夫森氏用含有单宁的染色液可使荚膜着色，效果良好。(一)器材1在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养3-5天的圆褐固氮菌或培

23、养2-3天的硅酸盐细菌。2石碳酸复红染色液、黑素液、李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液(见附录二)。3其他用具同简单染色。(二)步骤方法一：1挑取少量圆褐固氮菌或硅酸盐细菌涂片后待自然干燥(切勿加热固定)。2滴加石碳酸复红染色液染色2-4分钟，水洗、晾干。3取少量黑素液放在涂片的旁边，另取一片边缘整齐的载玻片将黑素在涂片上轻轻地刮过，推展成薄层。4镜检：菌体呈红色，背景黑色，中间衬托出无色的荚膜层。方法二：1涂片干燥同上法2滴加李夫森氏染色液染色10分钟，倾去染液(切勿水洗，加硼酸钠美兰染色液染色5分钟，水洗、晾干。3镜检：荚膜呈红色，菌体兰色。七、细菌鞭毛染色法鞭毛是细菌的运动器官。细菌的鞭毛

24、非常纤细，直径约0.0l-0.02微米，超出了普通光学显微镜的可见范围，故需用持殊的鞭毛染色法，才能把鞭毛显示出来。鞭毛染色是借媒染剂和染色液的沉淀作用，加粗鞭毛，使之达到普通光学显微镜的可见范围。(一)器材：1在牛肉膏蛋白胨斜面上连续移植3-5次的假单胞杆菌或变形杆菌，此培养物在染色前培养18-24小时。2鞭毛染色液A和B(见附录二)。3其他用具同简单染色。(二)步骤1涂片：在清洁的载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少量菌。在载玻片的水滴中轻沾几个，稍停(约30秒)将玻片稍倾斜使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后放平在空气中干燥。2染色：涂片干燥后，滴加A液染3-5分钟，用蒸水充分冲洗

25、，将残水沥干或用B液冲去残水，加B染液30-60秒钟，可在酒精灯上稍加热，使其产生蒸汽而染液不干，然后用蒸馏水冲洗、晾干。3镜检：油镜下菌体为深褐色，鞭毛为褐色。【注意事项】1要选择光滑无伤痕、而且是高度清洁无油污的载玻片。2有鞭毛的细菌不是任何时候都有鞭毛。一般用新制备斜面培养基接种后培养18-24小时，以在短期内经过多次反复移植的幼龄培养物为佳。涂片干后应尽快染色，不宜放置时间过长。3染色前可先用暗视野显微镜或悬滴玻片法检查细菌的运动性，如果细菌运动很活跃，即可进行鞭毛染色。4染液当日配制，染色效果最佳，在冰箱中保存一周一般仍可使用，如产生沉淀不宜使用。5一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏。6镜检时，要多找几个视野观察，有时只有部分涂片上染出鞭毛。八、细菌的伴晶体染色法少数芽孢杆