克隆载体PPT学习教案

1、会计学1 克隆载体克隆载体 噬菌体或病毒的噬菌体或病毒的DNADNA能被开发能被开发 成为基因工程的有用载体，因为成为基因工程的有用载体，因为 ： 1.1.高效率的感染性高效率的感染性能使外源基能使外源基 因高效导入受体细胞；因高效导入受体细胞； 2.2.自主复制繁殖性能自主复制繁殖性能使外源基使外源基 因在受体细胞中高效扩增。因在受体细胞中高效扩增。 第1页/共25页 （一）（一） - -噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 1 1、由外壳包装蛋白和、由外壳包装蛋白和-DNA-DNA组成组成 2 2、 - -DNADNA的物理图谱的物理图谱 （1 1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起）功能

2、相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少目前已经被确定的基因至少6161种，一半为必需种，一半为必需 基因基因 第2页/共25页 48.5kb （2 2）线状双链）线状双链DNADNA，两端各有一个，两端各有一个1212bpbp的互补单链的互补单链 （粘性末端，粘性末端，cohesivecohesive-end site-end site），称），称coscos site site ，粘性末端粘连接变成，粘性末端粘连接变成环状环状DNADNA。 lcoscos位点是噬菌体包装必需序列。位点是噬菌体包装必需序列。 第3页/共25页 功能区：裂解相关功能区：裂解相关S S和和R R

3、，复制相关，复制相关O O和和P P 非必须区：非必须区： 非必须，基因重组非必须，基因重组intint（intagrateintagrate ）及及xisxis（excisionexcision） 结构区：结构区：A A J19J19个基因，编码个基因，编码头、头、 尾部蛋白质尾部蛋白质 第4页/共25页 第5页/共25页 DNADNA复制早期：一个复制早期：一个ori ori ，双向复制，双向复制 晚期：滚环复制晚期：滚环复制-多个多个DNADNA分子形成线状多联体分子形成线状多联体 第6页/共25页 头部包装蛋白头部包装蛋白首先结合在首先结合在coscos区区的附近，形成的附近，形成包包

4、 装启动复合物装启动复合物，A A蛋白蛋白切割切割coscos位点位点。 包装包装 第7页/共25页 噬菌体感染大肠杆菌后，噬菌体感染大肠杆菌后，DNADNA直接直接整合整合到到宿宿 主细胞染色体主细胞染色体DNADNA上，并不裂解细胞，这种情况上，并不裂解细胞，这种情况 称为称为溶源状态溶源状态。 DNADNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。 整合主要由整合主要由cIcI和和intint基因的产物所激活，这两个基因的开放基因的产物所激活，这两个基因的开放 与关闭取决于宿主细胞本身的性质。与关闭取决于宿主细胞本身的性质。 cIcI基因：基因：编码阻遏蛋白

5、，编码阻遏蛋白，是感染了是感染了噬菌体的寄主细胞进噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。入溶源化的必要条件。cIcI基因失活或缺失基因失活或缺失的的噬菌体无法噬菌体无法 使寄主细胞使寄主细胞发生溶源化发生溶源化效应。效应。 第8页/共25页 噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNADNA上上 ，成为，成为原噬菌体原噬菌体。 适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体， 重新变成独立的复制子，这种过程叫做重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体原噬菌体 的删除作用。的删除作用。 l噬菌体噬菌体DNADNA的整合与删

6、除：的整合与删除： 溶源性细菌，由于含有溶源性细菌，由于含有原噬菌体原噬菌体，故不能再，故不能再 次被次被同种同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种 抗御抗御同种噬菌体再感染同种噬菌体再感染的特性叫做的特性叫做超感染免疫性超感染免疫性。 第9页/共25页 噬菌体的溶源和裂解噬菌体的溶源和裂解 第10页/共25页 - -DNADNA载体的构建载体的构建 噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷： 基因组太大（基因组太大（48.5kb48.5kb）；）； 酶切点太多，它有酶切点太多，它有5 5个个BamH1BamH1位点（位点（GGATCCGGATCC），），6 6 个个BgB

7、g位点（位点（AGATCTAGATCT），），5 5个个EcoREcoR位点（位点（ GAATTCGAATTC）。）。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNADNA。若相当于。若相当于噬菌噬菌 体的体的75-105%75-105%，那么只能接纳，那么只能接纳48.5kb48.5kb5%=2.425kb5%=2.425kb 的的DNADNA。 重组的重组的DNADNA分子难于直接导入宿主细胞分子难于直接导入宿主细胞利用体利用体 外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNADNA 。 第11页/共25页 切去部分非必须的区域；切去部分非必须

8、的区域； 抹去多余的限制性内切酶切割位点；抹去多余的限制性内切酶切割位点； 插入可供选择的标记基因；插入可供选择的标记基因； 建立体外包装系统。建立体外包装系统。 构建构建噬菌体克隆载体的基本策略：噬菌体克隆载体的基本策略： 第12页/共25页 插入型载体、取代型载体插入型载体、取代型载体 u根据切除的多少，将根据切除的多少，将-DNA分为两大类载体：分为两大类载体： 1、缩短长度、缩短长度 野生型野生型:上限上限51kb -DNA：48.5kb，外源基因，外源基因2.5kb -DNA上有上有40-50%的的DNA是复制，裂解所不必需的，是复制，裂解所不必需的， 切除便提高装载量。切除便提高装

9、载量。 第13页/共25页 经改造后经改造后只具有只具有一个一个可供外源可供外源DNA插入的插入的克隆位点克隆位点,长度长度 为为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为片段最大为14kb. 必须携带标记基因必须携带标记基因 第14页/共25页 具有具有成对的克隆位点成对的克隆位点,空载的载体空载的载体DNA只只26kb，不能被包，不能被包 装，无法进入受体细胞中去装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因不需要标记基因. 第15页/共25页 插入型载体只能承受插入型载体只能承受较小分子量较小分子量（一般在（一般在 10kb以内）的

10、外源以内）的外源DNA片段的插入，广泛片段的插入，广泛 应用于应用于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。 替换型载体可承受替换型载体可承受较大分子量较大分子量的外源的外源 DNA片段的插入，所以适用于片段的插入，所以适用于克隆高等克隆高等 真核生物的染色体真核生物的染色体DNA。 第16页/共25页 2、酶切位点的删除或增加、酶切位点的删除或增加 采用定点突变技术或甲基化酶处理必采用定点突变技术或甲基化酶处理必 需区内的酶识别序列使其失活。需区内的酶识别序列使其失活。 第17页/共25页 基因工程实验中使用的受体是具有基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变琥珀型突变 体校正功能体校

11、正功能的菌株。的菌株。 第18页/共25页 4、加装选择标记、加装选择标记 野生型野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加上缺少合适的选择标记，因此加 装选择标记是装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容。克隆载体构建的重要内容。 选择标记主要有两类：选择标记主要有两类： l免疫功能类标记免疫功能类标记 l颜色反应类标记颜色反应类标记 第19页/共25页 当当外源外源DNA插入插入到标记基因中，到标记基因中， 基因灭活，基因灭活， -重组分子便进入重组分子便进入 溶菌循环，溶菌循环，形成形成透明斑。透明斑。 第20页/共25页 第21页/共25页 5、建立、建立 -噬菌体的体外包装系统噬菌体的体外包装系统 体外包装原理：体外包装原理： 噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。 头部基因头部基因发生了发生了突变突变的噬菌体只能的噬菌体只能形成尾部和形成尾部和 头部蛋白所需的蛋白因子头部蛋白所需的蛋白因子； 将这两种突变型的噬菌体的将这两种突变型的噬菌体的提取物混合起来，提取物混合起来， 便能够在便能够在体外装配成