过江藤种子超低温保存技术规程

1、ICS11.120.01C 23团 体 标 准T/CACM 00X2019过江藤种子超低温保存技术规程Technical procedures for cryopreservation of Phylanodiflora(L.) Greene seeds 2019-0X-0X发布2019-0X-0X实施中华中医药学会 发布T/CACM 0012018目 次目 次I前 言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 种子的选择15 种子前处理26 种子保存量27 种子冷冻方式28 恢复培养2附录3参考文献4前 言本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写

2、给出的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所，中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，郑希龙，李榕涛，王秋玲，何明军，金钺，顾雅坤，符丽。IIT/CACM 0012018过江藤种子超低温保存技术规程1 范围本标准规定了过江藤（Phylanodiflora(L.) Greene）种子超低温保存过程中的术语和定义、保存种子的选择、种子前处理、种子保存的量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于过江藤种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不

3、可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1过江藤 Phylanodiflora(L.) Greene为马鞭草科（Verbenaceae）过江藤属（Phyla Lour.）单属种多年生匍匐草本植物，有木质宿根，多分枝，全体有紧贴丁字状短毛。全草入药，能破瘀生新，通利小便，治咳嗽、吐血、痢疾、牙痛、疖毒、枕痛、带状疮疹及跌打损伤等症。收载于全国中草药汇编（卷二）

4、（2014）。3.2过江藤果实 Phylanodiflora(L.) Greene fruits果实淡黄色，长约1.5 mm，内藏于膜质的花萼内。3.3过江藤种子 Phylanodiflora(L.) Greene seeds过江藤的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子黄褐色。3.4种子超低温保存 seed of cryopreservation 指将经过前处理的过江藤种子置于液氮（-196）中保存。4 种子的选择4.1 果实采收6月至10月，果实由淡黄色变为棕色时，即可采收，去除果皮，取出种子。4.2 种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于4 冰箱中保存备用（存放时间不超

5、过3 个月）。5 种子前处理5.1 生活力检测参照植物生理学实验指导中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定过江藤种子生活力。待测种子在30 35 温水中浸种2 h，随后取吸胀种子20粒，整齐地埋于备好的琼脂凝胶中，注意要将胚埋入凝胶中。将培养皿置于35 温箱中8h后观察结果。5.2 生活力计算在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数100%待保存的过江藤种子生活力应70%。5.3 含水量范围用尼龙网袋包裹过江藤种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为230000:1，室温条件下干燥处理

6、28 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由15%20%降至11%12%。参照GB/T 3543.6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。6 种子保存量过江藤种子保存量不少于500粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式过江藤种子超低温保存的冷冻方式为玻璃化法超低温冷冻，即即将装有种子的1 mL冻存管（每管100粒种子）置于装载液（LS）中并于25 处理种子20 min，再用玻璃化保护溶液（PVS2）冰浴处理种子30 min，换上预冷新鲜的PVS2后迅速投入液氮中进行超低温保存。8 恢复培养8.1 种子解冻处理液氮中至少

7、冻存24 h后，取出1个冻存管，立即放入40 水浴中快速解冻3 min，而后用洗涤液（DS）浸泡15 min，并用纯净水洗涤3次。8.2 冻后种子生活力检测取出50粒解冻后的种子，参照5.15.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力70%时视为保存成功。8.3 恢复培养将剩下50粒解冻后的过江藤种子，播种到带有无菌滤纸的发芽盒中，温度25 30 ，湿度7085%条件下培养。过江藤种子出芽周期大概1060 d。附录1 BTB的配制和保存方法精密称取BTB 0.1 g，溶解于煮沸过的100 mL纯水中，然后用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝

8、绿色，此液长期贮存于棕色瓶中。1.5% BTB琼脂凝胶：称量0.1% BTB溶液40 mL置于烧杯中，称取0.5 g琼脂，将其剪碎后加入杯中，加热并不断搅拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷却即可趁热倒入9 cm培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。 2 装载液（LS）的配制及保存方法精密称取蔗糖13.7 g，称量甘油11.9 mL，溶于液体MS培养基中，调pH至5.8，并定容至100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。 3 玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8 mL、乙二醇13.6 mL、二甲亚砜13.6 mL，称取蔗糖13.7 g，溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至1

9、00 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。注意：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。 4 洗涤液（DS）的配制及保存方法精密称取蔗糖41.1 g溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。参考文献1 中国植物志委员会.中国植物志第65(1)卷M.科学出版社.2004(1982):0192 Chen Shou-liang; Michael G. Gilbert. Verbenaceae M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 1994. 17: 1-49.3 王国强等