应用发酵技术读书报告

1、应用发酵技术读书报告刘云琳（2014141494027）一 目录1发酵:从过去的一门艺术,对未来的一种技能2发酵设备选择:实验室规模生物反应器设计注意事项3研究发酵实验室规模的膜蛋白生产4发酵罐操作模式5生物过程介质的设计与制备6发酵系统中生物活性的动力学建模7发酵系统生物活性动力学建模8发酵过程的规模化和规模化9即时原位内发酵测量10生物反应器SCADA系统11发酵过程中的基本统计分析12发酵罐的研究与发展二 贡献者名单鸣谢：感谢所有参与生产实用发酵技术的人。三 前言发酵是一种非常古老的习俗，可以追溯到几千年前。最近，发酵已被开发用于制造从化学简单的原料，如乙醇，到高达复杂的蛋白质结构的范围

2、广泛的材料制造。这一系列产品和工艺的出现，已经彻底改变了临床医学的实践和许多基础研究领域，也大大增加了对发酵领域的技术人员的需求。如今的关键问题是我们如何才能将这些技能传递给需要它们的人。本书从发酵发展的简要背景出发，以选择实验室发酵罐的标准，以及关于为膜蛋白表达装置实验室提供更专业化的需求为目的设置小型发酵实验室或套件。这本书从预发酵阶段（设备选择、实验室建立、培养技术、接种装备）来描述我们如何设计，控制规模，并监控发酵。第一章 发酵:一种来自过去的艺术，一种未来的技能布莱恩.麦克内尔11“发酵”的含义（1）发酵的起源在古代历史中遗失了，他的开始甚至可能追溯到史前时期。古埃及人和苏美尔人的知

3、识技术用于谷物淀粉转化为酒精。对于大多数历史，这些过程或基于果汁转化的类似过程代表了对“发酵”一词最普遍接受的解释。（2）狭义的发酵：现在的发酵指的是液体培养基中的微生物,植物或动物细胞生产有用的产品，或研究这些细胞生理的过程。（3）现代发酵：现代发酵工业主要是20世纪的产物，它的主要目标是生产一系列高价值的产品，而不是简单的乙醇。1.2.现代发酵技术（1）近年来，发酵技术在使用上有了很大的发展。当今的发酵工业处于一种不断变化的状态，其地位、产品范围和过程的规模都发生了迅速的变化。这在很大程度上受到宏观经济因素的影响，随着人类基因组的破译，靶点治疗的进步等发酵表达系统的建设有了重大进展。利用发

4、酵技术和知识推进药物/受体相互作用的研究是必要的。发酵技术为研究膜蛋白的功能，和对抗疾病，包括癌症、退行性疾病如阿尔茨海默氏症，哮喘等做出了杰出贡献。新发酵衍生的药物，包括生物药物，具有提高免疫特异性治疗并减少副作用的前景。这是临床医学中的一个革命时期，因为这些通过发酵途径制造的新药物开始进入市场。（2）“新”发酵产品：“新”发酵产品,治疗性蛋白质,抗体(简单和共轭)比以前的产品更复杂和昂贵,但是,这需要比以前更加注重发酵步骤。基本上，这些产品的“质量”（效力，疗效，稳定性和免疫原性）是由上游或发酵阶段决定，因此比以前更需要清晰的理解那个阶段的过程，如何最好地监控，并以可重复的方式进行操作。（

5、3）发展：随着干细胞的培养和复制技术的不断发展，个性化医疗的时代可能即将到来。这将使科学家和工程师在未来几年更了解文化技术的需要。因此，在不久的将来对发酵技能的需求可能会增加。第二章 发酵设备选择:实验室规模生物反应器设计注意事项2.1简介本章将介绍小型生物反应器的设计注意事项,并举例说明如何小规模“通用”实验室选择发酵设备常用于几种发酵过程的发酵设备。1.在第二次世界大战期间，人们因为大量需求抗生素而开始研究如何提高微生物的目的产物的产量。本章中的“小规模”定义为1L-20L。2.生物反应器本卷的生物反应器可用于一些目的，规模上/下研究，克隆选择，培养基的发展，过程的发展，并在某些情况下生产

6、。（1）生物反应器应该具备的基本条件：长时间无菌生产;满足当地相关法规;监测和控制以下参数:pH值的酸/碱的变化添加或二氧化碳的变化;混合培养，使微生物保持悬浮状态，维持一定的DO2值；所有这些都应该在不损害生物体的前提下实现；;能调节温度;无菌采样功能。（2）生物反应器应考虑的其他问题备用顶板的安装要保证能后期修理生物反应器放大缩小规模时要按照一定比例，以小型生物反应器为模拟生物反应器的实用性，从完成一次运行到另一次运行的转换时间手动处理问题，特别是在10L处加标尺时可能需要两个人进行安全手动处理。2.2生物反应器的类型本章重点是迄今为止最常用的生物反应器类型STR（搅拌釜反应器）。 1结构

7、：它主要由纵横比为约3:1的容器和通常通过头板驱动的混合系统组成，虽然一些蒸汽混合驱动系统通过底板驱动。头板将具有允许添加探针，试剂和气体以及去除样品的端口。头板上有探针添加处、试剂和气体以及样品脱除的端口。2.其他可替代STR的生物反应器：（1）塔式发酵罐：特点是高度与直径比高达6：1至15：1。塔式发酵罐通常通过位于发酵罐底部附近的一个简单的分布器喷射气体来充气。塔式发酵罐可以通过使用挡板产生沉淀区域来连续地操作，使产品可以被取出并且细胞可以返回到容器主体。（2）气升式发酵罐：搅拌系统（电机、传动轴、叶轮）由一个固定的燃气引入管流取代。容器内的流动：空气上升，然后含有细胞的介质下降，以确保

8、彻底混合。气升式发酵罐可以通过挡板提高混合程度。这些容器提的混合非常温和，因此特别适合于对剪切力太敏感而不能被叶轮混合的细胞。（3）灌注灌注式生物反应器：中空纤维室用于培养贴壁依赖型细胞。该系统由一束纤维组成，细胞在墨盒内的额外毛细管空间（ECS）中生长。媒介和气体通过毛细管进入ECS。中空纤维的替代方案是在搅拌釜反应器中使用微载体。微载体通常是色谱级DEAE sepadex珠子。珠子带正电荷,所以吸引带负电荷的动物细胞,并提供一个细胞可以生长的表面。小规模的搅拌釜生物反应器可以分为以下三个基本组。2.2.1高压灭菌系统高压灭菌系统也许是最常见的系统,或许是由于他们相对简单、低成本的实用要求。

9、所有这一切由本地控制器控制，该控制器可连接到SCADA（监控和数据采集包），该软件包将记录系统生成的所有数据并控制系统。SCADA的使用能提供比仅由本地控制器提供的更高级别的功能，这一点将在第10章中更详细地讨论。图2.1(a)代表一个典型的小规模高压灭菌系统。该容器由玻璃制成，带有不锈钢头板，并由一个驱动面板和一个本地控制器连接到一个SCADA（监控和数据采集包）服务。图2.1(a) 典型的小型台架式玻璃高压灭菌生物反应器2.2.2不锈钢蒸汽系统图2.1（b）显示了与图2.1（a）中体积相同的容器，但是由不锈钢制造。它与玻璃系统的关键区别在于，钢制容器具有通过管道输送的蒸汽供应器，从而在现场

10、进行灭菌，因此不再需要大型现场高压釜。（1）玻璃系统相比： 主要优点是能够承受超压，使用过压（高于大气压的系统运行）来提高氧气传输速率。而我们因为安全原因，不能将超压施加到玻璃容器。但一些运营商更喜欢高压灭菌生物反应器系统,因为他的污染更小。（2）蒸汽供应：蒸汽必须是无颗粒和无油的，因为这两者之一可以通过在容器中留下残余物而影响产品，或通过阻塞阀来损坏系统。蒸汽也需要干燥，因为水会冷凝导致一个冷点，使温度不能达到灭菌温度（通常为121摄氏度）。图2.1(b) 小型蒸汽生物反应器2.2.3一次性生物反应器图2.1（c）显示了一个单一的使用系统，该容器已被一个袋子替换。这种袋子是多层次的，符合与生

11、物过程接触的产品的所有标准，即它应该是脱落的，浸出的或螯合的。在下一节中我们将讨论袋子的结构方面。袋子经过预过滤处理，因此不需要高压釜或蒸汽供应。优点是周转时间(时间)被最小化。目前这些系统往往是局限于哺乳动物和昆虫细胞培养。图2.1（c）台式单用生物反应器在考虑上述任何系统之前，有一些基本要点需要决定，下面将讨论这些要点。2.3结构方面2.3.1结构材料 结构材料的选择是基于它显示以下物理特性：它必须是化学惰性的，使它不从介质中浸出元素或螯合元素（主要是金属离子）。这要求施工是化学惰性的材料，以及作为常识，也是一项监管要求，由FDA（食品和药物管理局制定）和MHRA（药物和保健产品监管署）的

12、设备被用于药物或诊断产品的制造。（1）生物反应器用料：大规模生物反应器（20公升以上）：材料主要取决于压力代码和手动处理。在20L以上规模的生物反应器，几乎都由不锈钢制成，主要是316升级不锈钢或等效不锈钢较小规模生物反应器：小规模的系统由硼硅玻璃制成，由316-L不锈钢制成的顶板和由聚四氟乙烯制成的O型密封圈封头。这种规模的系统可以由316L不锈钢制成。通常，以这种规模选择不锈钢的唯一原因是缺乏足够大的高压釜，需要施加过度压力或易于与硼硅酸盐玻璃粘附的培养物。表2.1中总结了316 L包含的其他元素，这些元素都有助于其性质。（2）材料：不锈钢：ra值：平均粗糙度金属电解抛光，得到超光洁度。这

13、些抛光剂被描述为具有ra(平均粗糙度)值。这意味着当某物被描述为0.4 ra抛光时，没有点高于金属表面上方的0.4mm。可以通过机械抛光而不是电抛光（其在金属表面上溶解峰）来实现更高的光泽度。然而，机械抛光可能会导致污物聚集，因为金属表面被折叠而不是溶解掉。优点是可清洁度高因为没有碎片垃圾产生，耐蚀性也高。表2.1 316L不锈钢组件的组成和功能硼硅玻璃：组成： SiO2 81，B2O3 13，Na2O+K20 4和Al2O3 2玻璃厚度和气泡的数量确定玻璃的强度塑料：大约4年前，Stedim推出了一种技术，它以袋子的形式添加了第三种材料：塑料。单用发酵罐是一个300毫米厚的六层不透气的袋子，

14、满足上面所讨论的所有标准。它为传统的STR（搅拌式反应器）的市场扩大做出了杰出贡献，原因如下：A)单次使用时间最短 B）成本大大降低C）系统的验证路线非常简单。这个系统的唯一缺点是缺乏实现更高OTR的叶轮和挡板，因此只限于对氧气需求有限的哺乳动物和昆虫细胞系统。2.3.2位置考虑系统应放置在一个适合其使用的环境。2.3.3基础条件该位置应具有适当的条件，通常为电力，冷冻水，空气，氧气，氮气或二氧化碳，以及在小规模蒸汽就位（SIP）系统的情况下，蒸汽有正确的体积，压力和温度 。2.3.4高压蒸气灭菌器大小指定系统时，容易忽略的一个重要因素和问题是可用高压蒸气灭菌器大小。还应考虑高压釜的类型，以及

15、前端或上部装载系统的手动处理的影响。2.3.5风险和控制欧洲生物技术联合会根据人类对风险的认识将微生物分为五类。（1）无害微生物（EFB Class 1）： 微生物从未被确定为人类疾病的致病因子，对环境不构成威胁。（2）低危微生物（EFB Class 2）： 可能导致人类疾病的微生物，因此可能对实验室工作人员造成危害。他们基本不在环境中传播，可有效预防和治疗。（3）中等风险微生物（EFB 3级）： 微生物对实验室工作人员的健康构成严重威胁，但对整体人类的风险相对较小。可有效预防和治疗。（4）高危微生物（EFB Class 4）： 导致人体严重疾病的微生物，对实验室工作人员和广大人群造成严重危害

16、。一般来说没有有效的预防性药物和有效的治疗方法。（5）环境风险型微生物：微生物对环境的威胁比对人类更为严重。他们可能造成严重的经济损失。通常认为，大量培养给定微生物会提高风险。因为发酵罐被充气和搅拌时，可能发生泄漏，则有可能通过气溶胶引起严重的环境污染。2.4容器设计2.4.1基本设计几乎所有小规模的容器，无论是玻璃还是钢铁，用于哺乳动物或细菌使用，都有一个基本的容器设计（图2.2）。它们由一个平板，直管壁和半球形底座组成，因为这样具有产生良好的混合特性，而不产生过大的剪切力。不锈钢和玻璃系统在建造容器壁上有不同。（1）玻璃系统有两种选择，无夹层和夹套，两者都与温度控制有关。无夹套是最简单和最

17、便宜的系统，依靠一个环绕的加热带或等同物来为系统供热; 可以通过将热交换器设置在容器内来除去热量。优点：无夹层系统相比能更准确和稳定的控制温度。缺点：水的高成本和连接的脆弱性。具有夹套的容器（图2.3）具有充水的外护套。水通过热输入和去除来执行温度调节。水温由外部热循环器调节。随着控制技术的发展，无夹套系统的稳定性和准确性已达到现在与夹套系统相匹配的水平。故只有对于通过直接加热无法实现的升高的温度（如70C），或者如果该过程需要快速的温度变化时使用具有夹套的容器，因为其传热面积大。图2.2典型的小型无夹层玻璃生物反应器图2.3典型的具有夹层的玻璃生物反应器（2）一个小型不锈钢容器（图2.4）在其热输入/去除方面的工作方式与夹套玻璃系统的方式大致相同，并具有外部调节的供水以控制热量输入/移除。图2.4小型不锈钢生物反应