大鼠胰腺发育过程中Munc13(一).doc

1、大鼠胰腺发育过程中Munc13(一)作者：袁庆新，刘超，滕丽萍，刘翠萍，周锦勇，郭靖，程梅，德伟【关键词】胚胎胰腺发育EffectofMunc131oninsulinsecretionduringpancreaticdevelopmentinrats【Abstract】AIM:ToinvestigatetheexpressionofMunc131duringvariousstagesofembryonicpancreaticdevelopmentinratsanddefinetheeffectofMunc131oninsulinsecretion.METHODS:Pancreataofrate

2、mbryonicday12.5（ E12.5 ） ,E15.5,E18.5,newborn,21dafterbirth （ P21 ）andadultratsweredissectedundermicroscoperespectively.Inaddition,theanimalmodelsofintrauterinegrowthretardation(IUGR)inratsweremadeby50%calorierestrictioninpregnantratsfromgestationalday15untilterm.AfterabstractionoftotleRNAandprotein

3、,thetechniquesofRTPCR,realtimePCR,WesternblotandELISAwereusedtostudytheexpressionofMunc131andinsulinsecretion.R ESULTS:ThegenesofinsulinandMunc131begantobeexpressedfromE12.5and E15.5respectivelyandtheirexpressionswereincreasedasthefetusgrew.Theres ultofWesternblotshowedthattheexpressionofMunc131wasl

4、owatE15.5andE 18.5andincreasedlater.BloodinsulinlevelwasdetectedatE18.5andincreasedr apidlythereafter.ThebloodinsulinlevelandtheexpressionofMunc131werered ucedsimultaneouslyinIUGRmodelscomparedwithnormalnewbornrats.CON CLUSION:TheexpressionofMunc131isaccordanttobloodinsulinlevelandplaysanessentialro

5、leininsulinexocytosis.【Keywords】Munc131;insulin/secretion;embryonicpancreaticdevelopment;diabetesmellitus;IUGR【摘要】目的：研究大鼠胰腺发育不同阶段Munc131基因及蛋白表达的变化及 Munc131 在胰岛素释放过程中的作用.方法：应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d（E12.5）,E15.5,E18.5,新生大鼠 ,出生后 21d（P21）及成年大鼠胰腺组织；另外，从大鼠胚胎发育15d 开始给予孕鼠半量饮食，造成宫内发育迟缓动物模型，提取其新生大鼠胰腺组织 .采用 RT

6、PCR,RealtimePCR和 Westernblot 技术确定 Munc131 的表达情况，并测定不同发育时期血中胰岛素浓度.结果：胰岛素基因从E12.5 开始出现， Munc131 基因从 E15.5 开始表达，随着胎龄的增长，二者表达量皆增多 .E15.5和 E18.5时 munc131 蛋白表达量较少，以后明显增多 .自 E18.5 即检测到血中胰岛素的存在，随着胚胎的发育，血胰岛素浓度逐渐升高 .宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低，同时 Munc131 基因及蛋白表达量亦比正常对照组明显减少.结论：Munc131 在胰岛素释放过程中的作用，随着胚胎发育期胰岛素分泌的增

7、多表达也增加， 宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时，Munc131的表达亦减少 .【关键词】 Munc131；胰岛素 / 分泌；胚胎胰腺发育；糖尿病；宫内发育迟缓0 引言胰岛素在细胞内合成后，以分泌颗粒的形式贮存在大致密囊泡中，在营养物质（葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）、神经递质、激素等刺激下，进入血循环，完成其调节体内营养物质代谢，调节生长发育，控制血糖动态平衡的生理作用 1-2.业已证实，胞吐过程是涉及许多蛋白因子的复杂过程，可溶性N 甲基马来酰胺融合蛋白附着蛋白受体(solublenethylmaleimidesensitivefusionproteinattachmentproteinr

8、eceptors,SNARE)复合体是胞吐过程所必须的分子构件；Munc，Synaptotagmin，Rab 等蛋白家族的不同成员是其重要的调节因子.这些因子在神经递质胞吐中研究得较多，但他们在胰岛素分泌过程中的确切作用及其精细功能如何尚无定论 3-5.我们运用基因芯片技术，已建立了大鼠不同发育阶段基因表达谱，初步明确了胰岛素释放的完善过程中相关基因的表达情况，在此基础上，我们重点从胰岛素释放关键因子之一Munc131 入手，探讨正常及异常胰腺发育情况下Munc131 表达的变化，阐述其在胰岛素释放过程中所起的重要作用，以期寻找糖尿病治疗的新靶点 .1 材料和方法1.1 材料 SD大鼠由南京医

9、科大学实验动物中心提供.18：00 将雌雄鼠合笼 ，次日晨 检测有 阴栓者 定为孕0.5d （ E0.5），分 别于受 精后12.5d(E12.5),15.5d(E15.5),18.5d(E18.5)，经颈椎脱臼处死孕鼠，剖腹取出孕子宫，分离胚胎，取出胰腺（E12.5,E15.5 胚胎胰腺需在解剖显微镜下分离），新生鼠出生后， 立即与母体分离， 迅速取出其胰腺 .出生后21d 鼠和成年鼠在低温条件下迅速取出胰腺6.部分孕鼠于 E15 开始给予正常卡路里的50%，直至出生，造成宫内发育迟缓动物模型，待新生鼠出生后， 立即取出其胰腺 .所有标本置液氮中速冻后-70冻存备用.分别取 E12.5 胚胎

10、胰腺 100 只、E15.5胚胎胰腺 30 只，E18.5 胚胎胰腺 10 只（来自 3 只孕鼠）,新生鼠 3 只（来自 3 只孕鼠），用 RneasyMiniKit（Qiagen公司）抽提并纯化总 RNA.总 RNA分装后 -70冻存，用于 RTPCR和 RealtimePCR.1.2 方法 RTPCR和 RealtimePCRRTPCR操作过程按试剂盒（日本 Toyoko 公司）提供常规步骤 .目的基因及内参照引物序列如下： G3PDHforward:5ACCACAGTCCATGCCATCAC3,reverse:5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3.Insulinforward:5

11、CCGTCGTGAAGTGGAG3,reverse:5CAGTTGGTAGAGGGAGCAG3.PDX1forward:5GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAA3,reverse:5CCAGTCTCGGTTCCATTCG3 .Munc131forward:5TGTGGAACAAGGGTCTCATCTGG3 .reverse:5GGCTGCGAAGTCGTGTAGTAAGG3.Munc131RealtimePCR探针设计如下：unc13h1fam:CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG，unc13h1fp:CGCTATGGCGTTGAATCCA，unc13h1rp:TGCGTAGTAGGCGTTGATGTTG分别. 取E15.5 的 胰 腺100只,E18.5的胰腺 20 只,新生大鼠胰腺6 只,出生后 21d 大鼠 6 只、成年大鼠 6 只 （ 雌 雄 各 3 只 ）， 分 别 按 15 （ m/V ） 加 裂 解 液（ 50mmol/LTrisCl,150mmol/LNaCl,1g/LSDS,100mg/LPMSF,10g/LNP40,10g/LTritonX100,10g/L蛋白酶抑制剂 cocktail），冰上匀浆，然后 300W 超声4s 14（间隔时间） 6次（保护、工作复位） ，静置 1h 后， 21500g 离心 15min，提取上清为总蛋白，用 Br