HPLC分析常见问题

1、HPLC分析常见问题 张庆合,李彤 大连依利特分析仪器有限公司 色谱过程 HPLC方法建立的步骤 1. 样品情况, 分离目的 2. 是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等？ 3. 选择设置检测器 4. 选择液相色谱法； 5. 预实验；估计最佳分离条件 6. 优化分离条件 7. 检查出现的问题或所需的特殊步骤 8. 论证方法使之进入常规实验室 样品组分和性质情况样品组分和性质情况 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量 化合物的pKa值 化合物的UV光谱图 化合物在样品中的浓度范围 样品的溶解度 分离的目的 1.定量？一种物质检出？未知组分确认？纯化？ 2.要解析出样品的

2、所有成分？ 3.准确度与精密度？ 4.方法应设计多少种不同的样品基质？特殊化 合物样品形式（如：原料药，一种或多种形 态，环保样品等） 5.一次将分析多少样品？牺牲样品分离度，如 缩短柱长或加快流速。 6.HPLC设备人员？柱恒温？梯度洗脱？方法 通用性？ 样品预处理与检测 1. 可直接进样的溶液 2. 需稀释、pH缓冲、加入内标或其它定容操作 3. 必须首先溶解或提取处理的固体 4. 样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱 或仪器不受损害的样品 方法建立和论证期间可能问题方法建立和论证期间可能问题 1.塔板数低：色谱柱选择，二次保留、峰形不好 2.色谱柱易变性：色谱柱选择，二次保留的影响

3、3.色谱柱寿命短：色谱柱选择、样品预处理、3 pH 7 4.保留值变化：色谱柱平衡不够、样品需预处理、键合相流 失 5.定量精度差：校正、找出误差的来源 6.出现新干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性。 分离的简单原则 出得来 分得开 尽量快 液相色谱常见问题液相色谱常见问题 不要总是首先埋怨不要总是首先埋怨 色谱柱色谱柱! 泵流速、压力不稳 泵内有气泡 溶剂过滤器阻塞 入口单向阀过滤片阻塞 泵中两种溶剂不互溶 柱塞密封泄漏 连接管路泄漏 单向阀装配图 单向阀清洗 1:4硝酸溶液、蒸馏水中超声清洗15分 钟两次 吹净里面的水份 按原位置重新装配在泵头上 在整体清洗单向阀组件无效时，拆开单 向

4、阀组件冲洗 检查安装方向 柱塞杆和密封环的维护 清洗柱塞杆后部 避免含盐流动相滞留在色谱系统 流动相与样品的过滤 溶剂过滤器与在线过滤器的清洗 HPLC常用连接管 检测器基本要求 灵敏度高、线性范围宽、通用 响应快、响应值不受温度及流动相影响 噪音低、漂移小 死体积小 对样品无破坏性 定性定量信息 方便便宜 UV检测器常见故障 灯：基线躁声、灯失灵、灯能量 检测池：气泡、阻塞、污染 波长：波长准确性、选择 基线噪声 样品或流动池污染 样品或参比池 中有气泡 记录仪或装置接地不良 检测器光源故障 连接件泄露 很小的气泡通过检测池 由泵的脉动引起的规则脉冲 有微粒通过检测池 进样阀样品环部分堵塞

5、基线漂移 流动池污染 柱污染或固定相流失 检测器温度变化 检测器光源故障 原先的流动相未完全置换 溶剂储瓶污染 强吸附的组分从色谱柱中洗脱下来 微粒造成进样阀柱头部分堵塞 溶剂分层 检测器气泡 0510152025 0 100 200 300 400 500 600 700 mV min 1. 柱头螺丝 2. 过滤筛板 3. 色谱柱管刃环 4. 柱头压帽 5. 色谱柱柱管 色谱柱结构 零死体积连接 2 -1 1 0 0 -1 0 -1 8 5 0 u m1 0 K VX 5 0 0 WD: 1 1 mm 3微米多孔二氧化硅微球 固定相基质类型 Si - O-H Si - O-H Si - O-

6、H Si - O-H Si - O-H 硅胶颗粒 表面硅羟基 键合相 Si - O- H Si - O-Si Si - O- Si - O-Si Si - O-Si 液相色谱固定相 烷基键合固定相表面 峰高或峰面积重复性差 进样体积不重复 检测器响应不正常 记录仪或工作站不正常 柱或检测器被样品超载 校准液或样品溶液或内标物分解 保留时间不重复 溶质与固定相作用 色谱柱填充不良 分析的准确度差 校准不适当 校准液或样品溶液或内标物分解 对内标物或欲测组分有未知干扰 溶质与固定相作用 色谱柱的保护 保护柱防止流 动相及样品 中杂质对色 谱柱的损害 色谱柱的保护色谱柱的保护 过滤所有的流动相及溶剂

7、 预处理样品去除强保留的组分 周期性地用强吸脱溶剂冲洗色谱柱 避免色谱柱温度高于60C 流动相 pH值介于 3 到 7之间 用新配制的缓冲溶液和水作为流动相 冲洗缓冲溶液后在100%有机溶剂中封盖储存) 避免碰撞敲击色谱柱或接头过紧 在pH 7或以上使用 键合致密的长链烷基固定相（C18、C8等） 硅溶胶工艺制的硅胶（Hypersil、Kromasil、 Spherisorb、Zorbax），经封尾的色谱柱 有机枸橼酸与硼酸缓冲液，避免用磷酸盐、胺 盐与碳酸盐） 保持0.010.05M的缓冲液浓度。 设定柱温 40C。 缓冲阳离子Li+ Na+ K+ NH+4 。 加碱性流动相改性剂保持长期分

8、离重现性。 HPLC中保留值与分离度变化 原 因 柱间差异担体、键合的不同 使用期间柱 变化 扰乱柱床，键合相丢失，硅胶担体溶解，非 流出物质堆积堵塞 柱外效应系统间：进样量大；进样阀与色谱柱之间和 /或色谱柱与检测器之间的管道体积大；检 测器体积大；接头体积大 分离控制不 好 流动相组分改变，流速改变，温度改变 柱平衡慢再平衡时间不足 柱超载样品质量太大 色谱柱常见问题色谱柱常见问题 背压过高 柱头筛板杜塞 柱外死体积 柱间重复性 柱床塌陷 鬼峰或假峰鬼峰或假峰 进样阀或注射器污染 样品溶剂与流动相不 同 样品中有空气 流动相中杂质引起 20%到100%甲醇梯度 选择性变化选择性变化 应用色

9、谱柱是否正确? 固定相表面是否有未 洗脱样品? 流动相pH、组成、温 度等 键合功能团流失? 在评价条件下重新检 测 柱外效应柱外效应 小于3mm内径的色谱柱 进样阀和色谱柱、色谱柱 和检测器之间用短的细内 径的连接管 用无死体积接头 用较小体积的检测池 进样体积减小 色谱峰分裂色谱峰分裂 柱外死体积 柱头填料污染 部分阻塞 进样阀密封问题 化合物一起洗脱 色谱峰展宽色谱峰展宽 所有的色谱峰展宽 柱效降低 进样体积太大 部分色谱峰展宽 上次进样洗脱的色谱峰 蛋白或聚合物等高分子 量化合物 色谱峰拖尾色谱峰拖尾 部分色谱峰拖尾 次级保留效应 残留硅 醇基的作用 在大峰的尾部有小峰 所有色谱峰拖尾

10、 柱外效应 柱头污染 重金属离子 色谱柱填充不理想 前伸峰前伸峰 色谱柱没有充分平衡 在主峰前有小色谱峰 负峰负峰 检测器输出信号的极 性相反 样品的吸收小于流动 相，流动相不纯 样品溶剂干扰 示差折光检测器中样 品的折射率较低 进样中带入气泡 色谱柱问题检查 色谱柱填料种类和规格? 样品和流动相种类? 保留、选择性、柱效、峰形问题? 是否用色谱柱检测溶质混合物进行检测? 样品基质是什么? 样品是否经过过滤? 是否用过滤的HPLC及溶剂? 色谱柱使用时间有多长? 色谱柱原来是否能够给出满意的结果? 是否更换或处理过色谱柱头的筛板? 色谱柱性能与原来的色谱柱存在差异? 请提供色谱分离的所有试验条

11、件. 色谱柱储存 固定相储存溶剂储存溶剂 反相(C18, C8, C4, etc.) 甲醇或乙腈 Phenyl甲醇或乙腈 CN (反相)乙腈 CN (正相) 3:97Heptane:IPA NH2, Diol, Silica 3:97 Heptane:IPA Elite色谱柱再生 每次冲洗用40到60倍柱体积的溶剂； 再生前后应该比较塔板数、峰形和k 值，确定再生效果 色谱柱的再生生 反相 正相 (C18, C8, Phenyl, CN (RP*) (Silica, NH2, CN, Diol) H2O:乙腈 90:10 1. 正己烷/氯仿 甲醇2.二氯甲烷 乙腈3.异丙醇 THF4.二氯甲烷 甲醇5.流动相 流动相6. 色谱柱再生 离子交换离子交换 蛋白提纯 SAX, SCX, DEAE, NH2, CM (C18, C4, C8, Ph