复方烟酸缓释片药动学研究

1、复方烟酸缓释片Beagle犬体内药代动力学研究于华 作者简介：于华（1978-），女（汉族），山东泰安人，硕士研究生，E - mail yuhua 7801；孙立新（1967-），女（满族）， 辽宁新宾人，副教授，主要从事化学药和中药的药代动力学研究，Tel. 024 - 23986365， E - mail slx 04。 ，孙艳2，孙峰3，王婷婷2，孙玉静2，孙立新1（1沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016；2沈阳华泰药物研究有限公司，辽宁 沈阳 110015；3沈阳东陵药业股份有限公司，辽宁 沈阳 110161）摘要：目的 建立RP-HPLC法同时测定比格犬血浆中烟酸及其主要代

2、谢物烟尿酸的药物浓度，并将建立的方法应用于复方烟酸缓释片Beagle犬体内烟酸药代动力学研究。方法 血浆样品用甲醇沉淀蛋白，上清液氮气流吹干，残留物用流动相复溶后分析，以富马酸为内标。色谱柱为Diamonsil C18 (4.6 mm 200 mm, 5 mm) 柱，流动相为甲醇-四丁基溴化铵（0.04 molL-1）(30:70，v/v)，流速为1.0 mLmin-1，柱温为20 C，检测波长为262 nm，6只Beagle犬随机交叉口服500mg复方烟酸缓释片和参比烟酸普通片后，用RP-HPLC法测定血浆中烟酸、烟尿酸的药物浓度。结果 烟酸在0.280.0 mgmL-1浓度范围内线性关系良

3、好，高、中、低3种浓度QC样品的日内、日间RSD均小于8.0%，提取回收率在90.097.8之间；烟尿酸在0.15.0 mgmL-1浓度范围内线性关系良好，高、中、低3种浓度QC样品的日内、日间RSD均小于9.1%，提取回收率在95.999.5之间。Beagle犬单剂量口服复方烟酸缓释片500 mg后，t1/2为（0.690.43）h，Tmax为（2.080.43）h，Cmax为（30.854.51）mgL-1，AUC0-12为 (59.9721.46) mghL-1，AUC0-为（68.5724.40）mghL-1。结论 该方法灵敏、快速、准确，操作简便，适用于血浆中烟酸浓度的测定和药代动力

4、学研究。单剂量口服复方烟酸缓释片后，测得的Cmax和AUC与烟酸普通片均有显著性差异，受试缓释片的Tmax长于参比普通片，Cmax低于参比普通片，说明受试缓释片无突释现象，有一定缓释效果。关键词：烟酸；烟尿酸；缓释片；血药浓度；药代动力学烟酸（Nicotinic acid）又名尼克酸，为B族维生素之一，烟酸半衰期短，仅2545 min，主要代谢产物为烟尿酸。临床上小剂量用于预防和治疗烟酸缺乏症。据文献报道1，大剂量时（每日36 g）有降血脂作用。大剂量使用烟酸，皮肤潮红和瘙痒等不良反应也随之增加，制成复方缓释制剂可减轻血药浓度过高造成的副反应，同时，烟酸缓释片降血脂作用可与一日一次给药的洛伐他

5、汀、辛伐他汀等药物相匹配。本研究参考文献2-6建立了同时测定Beagle犬血浆中烟酸及其主要代谢物烟尿酸血药浓度的分析方法，为复方烟酸缓释片的药代动力学研究提供试验依据。1 仪器与材料1.1 仪器 高效液相色谱系统，包括HP1100型输液泵及HP1100紫外-可见光检测器（美国安捷伦公司）；色谱柱为Diamonsil C18 (4.6 mm 200 mm, 5 mm) 柱（北京迪马公司）；Rev. A. 09. 03化学工作站（美国安捷伦公司）；柱温箱为AT-130型（苏州市莱顿科学仪器有限公司）。1.2 药品与试剂 烟酸对照品（批号：100434-200301，购自中国药品生物制品检定所）；

6、烟尿酸对照品（批号：20040801，纯度99.6%，由沈阳华泰药物研究有限公司提供）；内标为富马酸（批号：20021125，纯度99.5%，购自北京益利精细化学品有限公司）；复方烟酸缓释片（批号：040316，每片含烟酸500mg, 由沈阳华泰药物研究有限公司提供）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；四丁基溴化铵（分析纯，天津市博迪化工有限公司）；比格犬空白血浆（沈阳药科大学动物中心惠赠）。2 方法与结果2.1溶液的配制2.1.1 烟酸标准溶液的配制 精密称取烟酸25.0 mg置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度（1000 mgL-1），将上述溶液用甲醇分别稀释成0.4，0.8，4

7、.0，16.0，80.0，160.0 mgL-1的烟酸标准系列溶液，置于4 C冰箱内保存。2.1.2烟尿酸标准溶液的配制 精密称取烟酸25.0 mg置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度（1000 mgL-1），将上述溶液用甲醇分别稀释成0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，10.0 mgL-1的烟酸标准系列溶液，置于4 C冰箱内保存。2.1.3内标溶液的配制 精密称取烟酸25.0 mg置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度（1000 mgL-1），将上述溶液用甲醇稀释至160.0 mgL-1，置于4 C冰箱内保存。2.2 色谱条件色谱柱为Diamonsil C18 (4.6 mm 200

8、mm, 5 mm) 柱，流动相为甲醇-四丁基溴化铵（0.04 molL-1）(30:70,v/v),流速为1.0 mLmin-1，柱温为20C，检测波长为262 nm。2.3 给药与样品采集6只比格犬随机分为2组，于试验前12 h禁食，试验当日清晨分别口服1片复方烟酸缓释片(每片含烟酸500mg)和烟酸普通片(每片含烟酸500mg)，给药后继续禁食4 h。于服药前（0 h）和服药后0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0和12.0 h由后腿静脉采血2 mL并立即移入涂有肝素的试管内，离心（3500 rmin-1）10 min，分离血浆，于-20

9、 C冰箱中保存待测。2.4 血浆样品的处理取血浆100 mL加入50 mL内标溶液(160.0 mgL-1富马酸甲醇溶液)，混匀，加甲醇200 mL，涡流混合1 min，离心10 min (3500 rmin-1)，取上清液至另一试管中，室温氮气流下吹干，残留物溶于100 mL流动相，取20 mL进行HPLC-UV分析。2.5 方法的专属性在上述色谱条件下，对空白血浆、空白血浆加入对照品、Beagle犬服药后0.75 h血浆的色谱图进行比较。烟酸、烟尿酸和内标的保留时间分别为8.8 min、7.7 min和15.4 min。结果表明，空白血浆中的内源性物质及其他杂质不干扰烟酸、烟尿酸和内标富马

10、酸的测定，色谱图如图1A、B、C所示。A23CA121BA3A Chromatogram of a blank plasma sample;B Chromatogram of a blank plasma spiked with nicotinic acid, nicotinuric acid and fumaric acid;C Chromatogram of a beagle dog plasma sample after 0.75 h administration;1 nicotinuric acid 2 nicotinic acid 3 fumaric acidFig. 1 Typic

11、al chromatograms of nicotinuric acid, nicotinic acid and internal standard in plasma 2.6 标准曲线和定量下限取空白血浆100 mL，分别加入烟酸、烟尿酸标准系列溶液50 mL，配制成相当于烟酸血浆浓度为0.2, 0.4, 2.0, 8.0, 40.0, 80.0 mgL-1，烟尿酸血浆浓度为0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mgL-1的样品，其余按“血浆样品处理” 项下处理后作HPLC分析。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，求得回归方程。烟酸的回归方程为Y =

12、 3.965 10-2 X + 2.632 10-3（r = 0.9997，n=6），线性范围为0.280.0 mgL-1，定量下限为0.2 mgL-1；烟尿酸的回归方程为Y = 3.115 10-2 X + 7.270 10-4（r = 0.9993，n=6），线性范围为0.15.0 mgL-1，定量下限为0.1 mgL-1。2.7 精密度与准确度取空白血浆100 mL，按“2.6”项下的方法配制低、中、高3个浓度( 烟酸血浆浓度为：0.4，8.0，64.0 mgL-1；烟尿酸血浆浓度为：0.2，1.0，4.0 mgL-1) 的质量控制（QC）样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定三天，根据

13、当日的标准曲线，计算QC样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得本法的准确度与精密度。结果见表1。Concentration(mgL-1)RSD ( %)RE ( %)Intra-dayInter-daynicotinic acid0.4 7.38.0-5.98.03.64.3-0.5 64.05.26.33.0nicotinuric acid0.27.39.10.61.06.66.44.14.05.07.21.7表1 测定beagle犬血浆中烟酸和烟尿酸方法的精密度和准确度Table 1 Precision and accuracy for the analysis of nicotinic a

14、cid and nicotinuric acid in beagle plasma (n =6)2.8 提取回收率取空白血浆100 ml，按“2.6”项下的方法配制低、中、高3个浓度 (烟酸血浆浓度为：0.4，8.0，64.0 mgL-1；烟尿酸血浆浓度为：0.2, 1.0, 4.0 mgL-1)的质量控制（QC）样品，按“2.4” 项下处理后作HPLC分析。以提取后获得的色谱峰面积与未经提取获得色谱峰面积之比考察提取回收率。每一浓度进行6样本分析，烟酸在3个浓度的血浆样品提取回收率分别为90.0%、94.6%、97.8%，RSD分别为6.1%、6.2%、8.1%。烟尿酸在3个浓度的血浆样品提

15、取回收率分别为95.9%、99.2%、99.5%，RSD分别为3.0%、6.9%、6.8%。内标的提取回收率为93.2%，RSD为8.0%。2.9 稳定性取空白血浆100 ml，配制烟酸和烟尿酸低和高2个质量浓度（烟酸为0.4 mgL-1和64.0 mgL-1；烟尿酸为0.2 mgL-1和4.0 mgL-1 ）的血浆样品，考察血浆样品室温放置2小时，预处理后样品室温放置24小时，血浆样品-20C放置30天以及血浆样品反复冻融的稳定性。结果见表2。表2 烟酸和烟尿酸在Beagle犬血浆中的稳定性Table 2 Stability of nicotinic acid and nicotinuric

16、 acid in beagle plasma (n =3) Concentration(mgL-1)RE (%)2 h24h30dThe third freeze-thawingnicotinic acid0.464.0-4.1-2.3-4.2-6.564.0-3.80.3-0.2-1.2nicotinuric acid0.23.4-4.1-4.0-2.44.01.7-2.3-2.8-0.82.10 血药浓度测定与药时曲线 血浆样品按上述血浆样品的分析方法操作，并以当日的标准曲线计算各时间点样品中烟酸、烟尿酸的浓度，由QC 样品决定当日数据的取舍，六只Beagle犬单剂量口服500 mg复方烟

17、酸缓释片和500 mg烟酸普通片后，烟酸、烟尿酸平均血药浓度-时间曲线见图2和图3。图 2 六只beagle犬单剂量口服500 mg复方烟酸缓释片()和500 mg烟酸普通片()后，烟酸平均血药浓度-时间曲线.n = 6, sFig. 2 Mean plasma concentration time curve of nicotinic acid in 6 beagle dogs after a single oral administration of 500 mg complex nicotinic acid sustained-release tablet and rapid-relea

18、se nicotinic acid tablet 图 3 六只beagle犬单剂量口服500 mg复方烟酸缓释片()和500 mg烟酸普通片()后，烟尿酸平均血药浓度-时间曲线.n = 6, sFig. 3 Mean plasma concentration time curve of nicotinuric acid in 6 beagle dogs after a single oral administration of 500 mg complex nicotinic acid sustained-release tablet and rapid-release nicotinic a

19、cid tablet.2.11 复方烟酸缓释片在Beagle犬体内的药代动力学参数用DAS2.0软件计算得到的Beagle犬口服复方烟酸缓释片和烟酸普通片的主要药代动力学参数见表3。表3 6只Beagle犬口服500 mg复方烟酸缓释片和500 mg烟酸普通片后的主要药代动力学参数（ s，n = 6）Table 3 Pharmacokinetic parameters of sustained-release nicotinic acid tablet (500 mg) and rapid-release nicotinic acid tablet (500 mg) after oral ad

20、ministration in 6 Beagle dogs.parameterssustained-release nicotinic acid tabletrapid-release nicotinic acid tablettmax/h2.08 0.491.04 0.49cmax/ mgL-130.85 4.5168.05 20.48t1/2/h0.69 0.430.48 0.16AUC0-t/mghL-159.97 21.46134.27 40.02AUC0-/mghL-168.57 24.40140.45 42.653. 讨论3.1色谱条件的选择文献2的流动相为KH2PO4-K2HPO

21、4(加入四丁基溴化铵)乙腈，组成比较复杂，在缓冲盐中加入离子对试剂，其中缓冲盐对柱子损害大；本试验流动相为甲醇四丁基溴化铵，组成简单，只有甲醇和离子对试剂组成。3.2 血浆样品处理方法的选择文献3，5采用丙酮沉淀蛋白后，再用氯仿萃取，操作相对复杂。本试验采用甲醇直接沉淀蛋白的方法处理生物样品，该方法操作简单，提取回收率高，成本较低，适合大批量样品处理。3.3 内标的选泽 本文曾尝试富马酸、替硝唑、邻苯二甲酸、奥硝唑、诺氟沙星和依达拉嗪作为内标物，邻苯二甲酸保留时间在4 min左右，易受到内源性物质的干扰；依达拉嗪保留时间较长，在20 min左右，分析时间太长；其余的内标物在样品出峰处有干扰。富

22、马酸保留时间适宜，与样品能完全分离，并且不受内源性物质的干扰，故试验中选择富马酸作为内标物。3.4烟酸缓释制剂与普通制剂的比较 本试验中单剂量口服复方烟酸缓释片后，测得的Cmax和AUC与烟酸普通片均有显著性差异，受试缓释片的Tmax长于参比普通片，Cmax低于参比普通片，说明受试缓释片无突释现象，有一定缓释效果。本文建立的血药浓度测定方法，专属性强，灵敏度高，准确度高，操作简便，适用于复方烟酸缓释制剂的药代动力学研究。参考文献1 Insull W Jr, Mcgovern ME, Schrott H, et al. Efficacy of extended - release niacin

23、with Lovastatin for hypercholesterolemia : assessing all reasonable doses with innovative surfacegraph analysis J. Arch Intern Med, 2004, 164 :1121 1125.2 Shibata K. Simultaneous measurement of nicotinic acid and its major metabolite, nicotinuric acid in blood and urine by a reversed-phase high perf

24、ormance liquid chromatography J. Agric Biol Chem, 1988, 52 (11) : 2973 - 29763 Hengen N, Seiberth V, Hengen M. High-performance liquid chromatographic determination of free nicotinic acid and metabolite, nicotinuric acid, in plasma and urine. J. Clin Chem, 1978, 24 (10) : 1740 1743.4 Stein J, Hahn A

25、, Rehner G. High-performance liquid chromatographic determination of nicotinic acid and nicotinamide in biological samples applying post-column derivatization resulting in bathmochrome absorption shifts. J. Chromatogr B, 1995, 665: 71 78.5 Neuvonen PJ, Roivas L, Laine K, et al The bioavailability of

26、 sustained release nicotinic acid formulations. J. J Clin Pharmacol, 1991, 32: 473 476.6 陈钧，陆伟，蒋新国. 高效液相色谱法测定人血浆中的烟酸 J. 药物分析杂志, 2004, 24 (4): 349 351.Pharmacokinetic study of complex nicotinic acid sustained-release tablets in beagle dogsYU Hua1, SUN Yan2,SUN Feng3 WANG Ting ting2, SUN Yu-jing2, SUN

27、 Li-xin1,(1. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. Shenyang Pharmtech Pharmaceutical R&D Ltd. Shenyang 110015, China;3. ShenyangDongLingYaoYe Co.Ltd. ShenYang 110161,China. )Abstract：Objective To establish a method for the determination of nicotinic acid

28、and its major metabolite, nicotinuric acid in beagle dog plasma by RP-HPLC. The method can be applied to study the pharmacokinetics of complex nicotinic acid sustained-release tablets in beagle dogs. Methods: Plasma protein was precipitated by the addition of methanol. The supernatant solution was e

29、vaporated to dryness under nitrogen. The residue was reconstituted in mobile phase and was analyzed by RP-HPLC. Fumaric acid is used as the internal standard. The following Chromatography conditions were used: The column was Diamonsil C18(4.6 mm 200 mm,5 mm), mobile phase was methanol-tetrabutylammo

30、niumbromide (0.04 molL-1)(30:70,v/v). The flow rate was set at 1.0 mLmin-1. The column temperature was 20 C. Detection wave length was set at 262 nm.Single dose of complex nicotinic acid sustained-release tablet (500mg) and nicotinic acid rapid-release tablet (500mg) were given to six beagle dogs.Results : Nicotinic acid was a good linearity in the range of 0.2-80.0 mgL-1, The intra-day RSD and inter-day RSD were less than 8.0%, T