天然药物层析分离PPT

1、第六节层析分离第六节层析分离 层析分离法也称色谱法，是层析分离法也称色谱法，是19031903年年 俄国植物学家俄国植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命发现并命 名的。将植物色素溶液通过装有名的。将植物色素溶液通过装有CaCOCaCO3 3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各 种色素以不同的速率流动后形成不同的种色素以不同的速率流动后形成不同的 色带而被分开。色带而被分开。 色谱起源色谱起源 色谱色谱 组分 色素 石油醚石油醚 碳酸钙颗粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和图谱（）和图谱（graphsgraphs）

2、组）组 成色谱一词（成色谱一词（Chromatography) Chromatography) 。 一、层析分离法的基本原理一、层析分离法的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异，利用混合物中各组分物理化学性质的差异， 使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并 以不同的速度移动而达到分离的目的。以不同的速度移动而达到分离的目的。 物理物理 化学化学 性质性质 l 溶解度溶解度 l 分子极性分子极性 l 分子大小分子大小 l 分子形状分子形状 l 吸附能力吸附能力 l 分子亲合力等分子亲合力等 两相两相 流动相：携带样品流流动相：携带样品流

3、 过整个系统的流体过整个系统的流体 固定相：静止不动的固定相：静止不动的 一相一相 二、层析分离法的分类二、层析分离法的分类 流动相有两种状态流动相有两种状态： * *液体作为流动相液体作为流动相 * *气体作为流动相气体作为流动相 固定相也有两种状态：固定相也有两种状态： * *固体物质作为固定相固体物质作为固定相 * *以吸附在固体上的液体作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相 1 1、按两相所处的状态分类：、按两相所处的状态分类： 液相层析液相层析 液液- -固层析固层析 液液- -液层析液层析 气相层析气相层析 气气- -固层析固层析 气气- -液层析液层析 吸附层析吸附层析：利用吸

4、附剂表面对不同组分吸附：利用吸附剂表面对不同组分吸附 性能的差异。性能的差异。 分配层析：分配层析：利用不同组分在流动相和固定相利用不同组分在流动相和固定相 之间的分配系数的不同。之间的分配系数的不同。 离子交换层析：离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂利用不同组分对离子交换剂 亲和力的不同。亲和力的不同。 2、 按层析的分离机理分类：按层析的分离机理分类： 凝胶层析：凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小利用某些凝胶对于不同分子大小 的组分阻滞作用的不同。的组分阻滞作用的不同。 亲和层析亲和层析：利用不同组分与配基之间所具有：利用不同组分与配基之间所具有 的专一而可逆的亲和力，使生物分子分

5、离的专一而可逆的亲和力，使生物分子分离 层析聚焦：层析聚焦：将两性物质的等电点特性与离子将两性物质的等电点特性与离子 交换层析相结合，使组分分离。交换层析相结合，使组分分离。 柱层析柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。向移动而达到分离。 纸层析：纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以 纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定

6、。 3、按操作形式不同分类：、按操作形式不同分类： Column Chromatography l层析装置：层析装置： l 梯度混和器梯度混和器 l 蠕动泵蠕动泵 l 层析柱层析柱 l 监测仪监测仪 l 记录仪记录仪 l 收集器收集器 三、柱层析设备三、柱层析设备 蛋白蛋白质质定量定量-分光比色分光比色仪仪(A280)法法 蛋白质分子中的蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸 和苯丙氨酸残基和苯丙氨酸残基（主要是主要是色氨酸色氨酸TrpTrp和和 酪氨酸酪氨酸Tyr Tyr 的的共轭双键共轭双键）对紫外光有对紫外光有 吸收，以吸收，以色氨酸色氨酸吸收最强，最大吸收吸收最强，最大吸收 峰为峰

7、为280nm。 在波在波长长280nm具有吸光的具有吸光的氨氨基酸基酸 紫外吸收法紫外吸收法 平衡、吸附平衡、吸附 盐盐梯度梯度冲冲洗洗 分管收集分管收集 蛋白蛋白测测定定制图制图 测测A280 l分离前：分离前： l1 1）树脂预处理：）树脂预处理：凝胶溶涨。离子交换纤维凝胶溶涨。离子交换纤维 素需作酸碱处理。素需作酸碱处理。 l2 2）装柱）装柱：重力沉降法，要求重力沉降法，要求均匀，无气泡。均匀，无气泡。 l3 3）平衡）平衡：层析柱使用前，须用层析柱使用前，须用缓冲液缓冲液平衡平衡 至所需的至所需的pH值和离子强度值和离子强度。 四、层析操作四、层析操作 l分离中分离中： 上样：上样：

8、体积尽可能小。体积尽可能小。 平衡平衡：用缓冲液使不被吸附的杂蛋白穿过。用缓冲液使不被吸附的杂蛋白穿过。 洗脱：洗脱： 连续梯度洗脱：连续改变缓冲液的连续梯度洗脱：连续改变缓冲液的pH或离子强度。或离子强度。 阶梯式梯度洗脱：分段地改变缓冲液的阶梯式梯度洗脱：分段地改变缓冲液的pH或离子强度。或离子强度。 等温平衡洗脱：用平衡缓冲液直接进行扩展洗脱。等温平衡洗脱：用平衡缓冲液直接进行扩展洗脱。 同时进行分步收集和检测。同时进行分步收集和检测。 分离后分离后：再生，平衡，保存。再生，平衡，保存。 1. 原理原理 利用固定相的吸附剂表面对不同组分吸附利用固定相的吸附剂表面对不同组分吸附 力的大小及

9、洗脱液对它的解吸作用的差异进行力的大小及洗脱液对它的解吸作用的差异进行 分离。吸附力弱而解吸力强的物质，移动快，分离。吸附力弱而解吸力强的物质，移动快， 先洗脱出来；反之则移动慢，后洗脱出来。先洗脱出来；反之则移动慢，后洗脱出来。 （一）吸附层析（一）吸附层析（adsorption chromatography） 五、常用的层析法五、常用的层析法 2、洗脱方法洗脱方法 1 1）溶剂洗脱法：采用单一或混合的溶剂进行洗）溶剂洗脱法：采用单一或混合的溶剂进行洗 脱的方法，是目前应用最广的方法。脱的方法，是目前应用最广的方法。 用洗脱液体积对各组分浓度作图得出洗脱曲线用洗脱液体积对各组分浓度作图得出洗

10、脱曲线 2 2）置换洗脱法：用置换剂洗脱。）置换洗脱法：用置换剂洗脱。 置换洗脱液中含有一种吸附力大于各组分的物质置换洗脱液中含有一种吸附力大于各组分的物质 3 3）前缘洗脱法：洗脱液为样液本身。）前缘洗脱法：洗脱液为样液本身。 吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附 物质的性质有关。物质的性质有关。 吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选 择择。 吸附剂吸附剂吸附剂通过范德华力、静电引力、吸附剂通过范德华力、静电引力、 疏水作用等与待分离物质的极性官能团作疏水作用等与待分离物质的极性官能团作 用用。 1 1）吸附剂的类型：）吸附剂的

11、类型： 根据吸附能力强弱分为：根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭强吸附剂：氧化铝、活性炭 3、吸附剂与洗脱剂的选择吸附剂与洗脱剂的选择 酶分离中常用的有：酶分离中常用的有：活性炭、硅藻土、活性炭、硅藻土、 羟基磷灰石等。羟基磷灰石等。 这些吸附剂在低这些吸附剂在低PHPH值、低离子强度下，对值、低离子强度下，对 酶有较强的吸附作用，在提高酶有较强的吸附作用，在提高PHPH值、增加离子值、增加离子 强度的条件下，酶可被解吸而洗脱下来。强度的条件下，酶可被解吸而洗脱下来。

12、2）吸附剂的性质：）吸附剂的性质： 活性炭：活性炭：常用的吸附剂。常用的吸附剂。 硅胶：硅胶：常用的极性吸附剂。常用的极性吸附剂。 羟基磷灰石羟基磷灰石 （HA） CaCa10 10(PO (PO4 4) )6 6.(OH).(OH)2 2 : 微晶型的磷酸钙制品，微晶型的磷酸钙制品，表面有表面有CaCa2+ 2+和 和POPO4 43- 3-两 两 种带电基团；种带电基团； 酸性和中性蛋白质可与酸性和中性蛋白质可与CaCa2+ 2+结合；碱性蛋白 结合；碱性蛋白 质可与质可与POPO4 43- 3-结合。 结合。 吸附原理是吸附原理是HAHA的的CaCa2+ 2+与蛋白质的负电荷基团 与蛋白

13、质的负电荷基团 作用。作用。 3）吸附剂的选择：）吸附剂的选择： 吸附剂的选择根据相似相溶原则：吸附剂的选择根据相似相溶原则： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质；极性强的吸附剂易吸附极性强的物质； 非极性的吸附剂易吸附非极性的物质；非极性的吸附剂易吸附非极性的物质； 溶液中溶解度越大的物质越难被吸附；溶液中溶解度越大的物质越难被吸附； 但为了便于解吸附，对于极性强的物质通但为了便于解吸附，对于极性强的物质通 常选用极性弱的吸附剂进行吸附。常选用极性弱的吸附剂进行吸附。 2. 洗脱剂洗脱剂 要求：要求：粘度小，纯度高，粘度小，纯度高，稳定性好，完全稳定性好，完全 洗脱下所要分离的成分洗脱下所要分

14、离的成分, ,易与目标分子分离。易与目标分子分离。 原则：原则：具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流 动相。对动相。对极性组分用极性大的洗脱液；非极性组分用极性大的洗脱液；非 极性组分用非极性洗脱液。极性组分用非极性洗脱液。 生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。 （二）分配层析（二）分配层析 分配层析是利用各组分在分配层析是利用各组分在 两相中的两相中的分配系数分配系数不同，不同， 而使各组分分离的方法。而使各组分分离的方法。 分配系数分配系数K固定相中溶固定相中溶 质浓度质浓度/流动相中溶质浓流动相中溶质浓 度度 K与溶剂和溶质

15、的性质有关，与溶剂和溶质的性质有关， 同时受温度、压力等条件的影同时受温度、压力等条件的影 响，在层析条件确定后，响，在层析条件确定后，K值值 是一个常数是一个常数。 利用离子交换剂上的可解离基团（活性利用离子交换剂上的可解离基团（活性 基团基团) )对各离子的亲和力不同而将物质分离对各离子的亲和力不同而将物质分离 的层析分离方法的层析分离方法 （三）离子交换层析（三）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 根据待分离物质带电性质不同而将物质分离根据待分离物质带电性质不同而将物质分离 平衡常数（分配系数）平衡常数（分配系数）K K组分离子在离子交换剂组

16、分离子在离子交换剂 上的浓度上的浓度/ /组分离子在溶液中的浓度组分离子在溶液中的浓度 K K值大的后洗脱下来，值大的后洗脱下来，K K小的先洗脱下来小的先洗脱下来. .带电荷量少带电荷量少， 亲和力小的亲和力小的先先被被洗脱洗脱下来，下来，带电荷量多带电荷量多，亲和力大的，亲和力大的后后被被洗脱洗脱下来下来 1.1.原理原理: : 1）离子交换剂）离子交换剂： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。 如羧甲基纤维素离子交换剂组成如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤维素纤维素O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ + 载体载体 电荷基团电荷基团

17、反离子反离子 2.2.离子交换剂与处理离子交换剂与处理 化学原料合成化学原料合成 ：树脂类物质：树脂类物质 载体载体 天然材料制成：天然材料制成： cellulose cellulose sephadex sepharose (纤维素葡聚糖凝胶纤维素葡聚糖凝胶) 阳离子交换剂阳离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（） 电荷基团如：电荷基团如： CM-Sepharose （CM：羧甲基）：羧甲基） 阴离子交换剂阴离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（） 如：如：DEAE-纤维素纤维素 （DEAE：二乙基氨基乙基）：二乙基氨基乙基） 离子交换剂离子交换剂

18、 -带有电荷基团的带有电荷基团的不溶性不溶性载体载体 -O-CH2CH2N-H CH2CH3 CH2CH3 Cl- 载体载体 Diethylaminoethyl (DEAE) 阴离子交换剂阴离子交换剂 (可吸附可吸附带负电的蛋白质带负电的蛋白质) 阳离子交换剂阳离子交换剂 (可吸附可吸附带正电的蛋白质带正电的蛋白质) l阴离子交换剂：阴离子交换剂： l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基 l阳离子交换剂：阳离子交换剂： l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3 DEAE C2H4N+(C2H5)2H QAE C2H

19、4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 l 以以Sephadex G-25, G-50为骨架，接入为骨架，接入 离子交换基团。离子交换基团。 l DEAE（QAE） Sephadex A-25，A-50 CM（SP） Sephadex C-25，C-50 A：anion 阴离子阴离子 C: cation 阳离子阳离子 类型类型说明说明功能基功能基反离子反离子 DEAE-Sephadex DEAE-Sephadex A-25 A-25 ，A-50A-50 弱碱性阴离弱碱性阴离 子交换剂子交换剂 二乙氨基己基二乙氨基己基氯氯 QAE-Sephadex QAE-Sephadex A-25 A-

20、25 ，A-50A-50 强碱性阴离强碱性阴离 子交换剂子交换剂 二乙氨基己二乙氨基己 基基2-2-羟丙羟丙 基基 氯氯 CM-Sephadex CM-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50 弱酸性阳离弱酸性阳离 子交换剂子交换剂 羧甲基羧甲基钠钠 SP-Sephadex SP-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50 强酸性阳离强酸性阳离 子交换剂子交换剂 磺丙基磺丙基钠钠 原则：原则：根据被分离物质的性质选择根据被分离物质的性质选择同一性质离同一性质离 子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力 差异大差异大的型号

21、交换剂，以保证通过离子交换层析的型号交换剂，以保证通过离子交换层析 后能得到比较满意的结果。后能得到比较满意的结果。 考虑因素考虑因素p100 3）离子交换剂的选择）离子交换剂的选择 a. 强、弱离子交换剂的选择：强、弱离子交换剂的选择： 强酸强碱型：适用的强酸强碱型：适用的pH范围广，范围广，制备无离子水制备无离子水 弱酸弱碱型：适用的弱酸弱碱型：适用的pH范围窄，范围窄，分离生物大分子分离生物大分子 物质物质 b. 阴、阳离子交换剂的选择：阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性酶的稳定性 若若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂 pH 值如何影响蛋白质的

22、电荷数值如何影响蛋白质的电荷数 2468101214 0 系统系统 pH + 蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷 蛋白蛋白质带负电质带负电荷荷 等等电点电点 - 实验设计原实验设计原理理 利用不同的蛋白利用不同的蛋白质质分子在溶液中所分子在溶液中所带电带电 荷荷不同，因而不同，因而与离子交换剂与离子交换剂有不同吸附力有不同吸附力 而而分离。分离。 pH6.0 pI 6.0 蛋白蛋白质带质带正正电电pI 6.0 蛋白蛋白质带负电质带负电 4 4）离子交换剂的处理）离子交换剂的处理 p100 3. 操作操作 装柱装柱 平衡平衡 上样上样 洗脱洗脱 再生再生 1）上样：）上样：上样体积不十分严格。上样体积

23、不十分严格。 2）洗脱）洗脱: 增加溶液的离子强度增加溶液的离子强度 梯度洗脱法梯度洗脱法 改变溶液的改变溶液的pH值值 3）再生：）再生：用用0.5mol/LNaOH和和0.5mol/L NaCl混混 合溶液或合溶液或0.5mol/L HCl处理。处理。 4.4.应用应用 制备纯化生物大分子制备纯化生物大分子 图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线 （a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶

24、孔，流程长而小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而 后流出层析柱。后流出层析柱。 1. 基本原理基本原理 凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= Vi Vo外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙 的体积（的体积（ml） Vi内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微 孔体积的总和（孔体积的总和（ml） Ve某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流 出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml） 凝胶过滤柱色谱洗脱的三

25、种峰凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰 . K. Kd d=0=0时时, ,即即Ve=Vo,Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，说明该组分分子量足够大，不进入微孔， 最先流出。最先流出。 . K Kd d=1=1时时, ,即即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙 ，最后流出。，最后流出。 . 其它组分其它组分0K0Kd d1,1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。因分子大小而改变洗脱峰的位置。KdKd小的小的 先流出，先流出，KdKd大的后流出。大的后流出。 Ve-Vo Kd= Vi KdKd的取值范围是的取值范围是0 01 1。

26、 但如果凝胶对待分离组分有吸附作用时，但如果凝胶对待分离组分有吸附作用时， KdKd将大于将大于1 1 洗脱顺序按洗脱顺序按KdKd值由小到大先后洗脱下来值由小到大先后洗脱下来 1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。可定量地衡量各组分的流出顺序。 Kd值小先洗脱，值小先洗脱， Kd大后洗脱大后洗脱 2) 判断分离效果，判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，差异大，分离效果好， Kd差异小，分离效果差。差异小，分离效果差。 分配系数分配系数Kd的意义：的意义： 1)1)交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（dextran gel)dextran gel) 商品名商品名:Sephadex:Sephadex

27、 型号型号 Sephadex GSephadex G1010至至G-200 G G-200 G 后的后的 数字为凝胶吸水值的数字为凝胶吸水值的1010倍。数字越大，交联倍。数字越大，交联 度越小，孔径越大，分离范围越广。度越小，孔径越大，分离范围越广。 单体：萄聚糖交联剂：单体：萄聚糖交联剂：1,2-1,2-环氧氯丙烷环氧氯丙烷 此胶的化学稳定性好此胶的化学稳定性好, ,用于各种物质的分离用于各种物质的分离. . 2.凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质 凝胶型号凝胶型号 颗粒大小颗粒大小 /m/m 溶胀体积溶胀体积 /(ml/g)/(ml/g) 分离范围（分离范围（MrMr） Sephadex

28、G-10Sephadex G-10 Sephadex G-15Sephadex G-15 Sephadex G-25Sephadex G-25 Sephadex G-50Sephadex G-50 Sephadex G-75Sephadex G-75 Sephadex G-100Sephadex G-100 Sephadex G-150Sephadex G-150 Sephadex G-200Sephadex G-200 4 4120120 4 4120120 5050150150 5050150150 4040120120 4040120120 4040120120 4040120120 2

29、 23 3 2.52.53.53.5 4 46 6 9 91111 12121515 15152020 20203030 20203030 小于小于7 710102 2 小于小于1.51.510103 3 1.01.010103 35.05.010103 3 1.51.510103 33.03.010104 4 3.03.010103 38.08.010104 4 4.04.010103 31.01.010105 5 5.05.010103 33.03.010105 5 5.05.010103 36.06.010105 5 葡聚糖凝胶层析介质的有关参数葡聚糖凝胶层析介质的有关参数 2 2）琼脂

30、糖凝胶（）琼脂糖凝胶（agarose gel)agarose gel) 商品名商品名:Sepharose :Sepharose （瑞典）（瑞典）; ; Bio-Gel A ( Bio-Gel A (美国）美国） 依靠糖链之间的次级键维持网状依靠糖链之间的次级键维持网状 结构，琼脂糖密度越大，网状结构越结构，琼脂糖密度越大，网状结构越 密集。密集。 型号型号 使用范围（蛋白质的分子量）使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖含琼脂糖 （） 6B 6B Sepharose 4BSepharose 4B 2B 2B 10104 43 310106 6 10105 53 310107 7 10106 610

31、108 8 6 6 4 4 2 2 6B 6B Sepharose CL 4BSepharose CL 4B 2B 2B 同上同上 同上同上 0.5m 0.5m Bio-Gel A 1.5m Bio-Gel A 1.5m 5m 5m 15m 15m 50m 50m 150m 150m 101050050010103 3 101015001500 101050005000 40401500015000 1001005000050000 1000 1000150000150000 1010 8 8 6 6 4 4 2 2 1 1 SepharoseSepharose及及Bio-gel A Bio-

32、gel A 型号型号 3 3）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gelpolyacrylamide gel） 商品名为商品名为Bio-Gel,Bio-Gel,型号从型号从 Bio-Gel PBio-Gel P 2 2至至P-300P-300，P P值越大，孔径也越大。值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰 胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。 1）凝胶的选择和处理）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的根据相对分子质量范围选择相应型号的 凝胶介质。凝胶介质。 将干胶悬浮于将干

33、胶悬浮于510倍的倍的蒸馏水中蒸馏水中 ，充分，充分 溶胀，抽气，装柱。溶胀，抽气，装柱。 2）柱的选择）柱的选择 采用采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，比值高的柱子，可提高分辨率， 但影响流速但影响流速。 3. 操作：操作： 3）加样）加样 体积不能过多，不超过床体积的体积不能过多，不超过床体积的10，最多，最多 不大于不大于30。 4）洗脱）洗脱 洗脱液与平衡时用的洗脱液与平衡时用的buffer一致。一致。 洗速不可过快，保持恒速。洗速不可过快，保持恒速。 5）胶的保存）胶的保存 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态， 不必再生处理。不必再生处

34、理。 用用0.02%NaN3防腐。防腐。 1）脱盐）脱盐 ) 生物大分子物质的生物大分子物质的分离纯化分离纯化 3）分子量的测定）分子量的测定 4）溶液浓缩）溶液浓缩 4. 应用应用 LogMLogM A A B B C C LogMLogM 测测 V V测测 Ve=k=k1 1-k-k2 2LogM （VeVe为洗脱体积）为洗脱体积） 先测得几种标先测得几种标 准蛋白质的准蛋白质的VeVe，并，并 以其分子量对数对以其分子量对数对 VeVe作图得一直线，作图得一直线， 再测出待测样品的再测出待测样品的 VeVe，查标准曲线即，查标准曲线即 可确定分子量。可确定分子量。 蛋白质的洗脱体积与其分

35、子量有关蛋白质的洗脱体积与其分子量有关 以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相 应管的应管的A A280 280为纵坐标，绘制洗脱曲线。 为纵坐标，绘制洗脱曲线。 根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱 体积体积VeVe，然后以蛋白质分子量的对数值，然后以蛋白质分子量的对数值 （logMrlogMr）为纵坐标、）为纵坐标、VeVe为横坐标，作出分为横坐标，作出分 子量标准曲线。子量标准曲线。 样品完全按照标准曲线的条件操作，根样品完全按照标准曲线的条件操作，根 据紫外检测获得的洗脱体积，从分子量标据紫外检测获得的洗脱体积，从分子量标

36、准曲线查出相应的分子量。准曲线查出相应的分子量。 由吸附层析发展起来的由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和，是从复杂混和 物中纯化蛋白质的最好方法。物中纯化蛋白质的最好方法。 又称：又称： 功能层析（功能层析（function chromatographyfunction chromatography） 生物专一吸附（生物专一吸附（biospecific adsorptionbiospecific adsorption） 选择层析（选择层析（selective chromatographyselective chromatography） （五）亲和层析（五）亲和层析(Affinity (Af

37、finity Chromatography)Chromatography) 利用生物大分子间利用生物大分子间特异的亲和力特异的亲和力来来 纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶 和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体； RNARNA和其互补的和其互补的DNADNA等。等。 1.原理原理 将待纯化物质的特异配体通过适将待纯化物质的特异配体通过适 当的化学反应共价的连接到载体上，当的化学反应共价的连接到载体上， 待纯化的物质可被配体吸附，杂质则待纯化的物质可被配体吸附，杂质则 不被吸附，不被吸附，从层析柱流出，从层析柱流出，变换洗脱变换洗脱

38、 条件，即可将条件，即可将欲分离的物质洗欲分离的物质洗脱下来脱下来， 实现分离提纯。实现分离提纯。 母体（载体）母体（载体） 配基：抗原、底物或辅酶或抑制剂、受体配基：抗原、底物或辅酶或抑制剂、受体 + C CC 配基配基 蛋白质蛋白质 1.配基固相化配基固相化2.亲和吸附亲和吸附 固体载体固体载体 3.解吸附解吸附 Affinity chromatography 根据欲分离组分与配基的结合特性根据欲分离组分与配基的结合特性, ,亲和层析亲和层析 可以分为：可以分为： 共价亲和层析共价亲和层析 疏水层析疏水层析 金属离子亲和层析金属离子亲和层析 免疫亲和层析免疫亲和层析 染料亲和层析染料亲和层

39、析 凝集素亲和层析凝集素亲和层析 理想的载体应满足以下要求：理想的载体应满足以下要求： 高度的亲水性。高度的亲水性。 极低的非特异性吸附性（惰性）。极低的非特异性吸附性（惰性）。 具有足够的化学基团。具有足够的化学基团。 适当的多孔性。适当的多孔性。 较好的理化稳定性。较好的理化稳定性。 2. 载体的选择载体的选择 可被应用的载体可被应用的载体： （按性能优劣排序）（按性能优劣排序） 琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝 胶、纤维素。胶、纤维素。 最常用的是琼脂糖，最常用的是琼脂糖，Sepharose 1BSepharose 1B到到10B10B 一对可逆结

40、合的生物分子中与载体相偶一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。辅酶等。 优良配体须具备的条件：优良配体须具备的条件： 1）与待纯化的物质有较强的亲和力。）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。）具有与基质共价结合的基团。 3. 配体的选择配体的选择 所要分离的目所要分离的目 的产物的产物 相应的配基相应的配基 酶酶 抗体抗体 凝集素凝集素 激素激素 底物、抑制剂、辅酶（辅因子）底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体多糖、糖蛋白、细胞受体 受

41、体、载体蛋白受体、载体蛋白 目的产物与相应的配基目的产物与相应的配基 配体一定，改造载体（基质）配体一定，改造载体（基质） 1）基质活化：）基质活化： 不同的载体活化需要不同的活化剂。不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（常用：溴化氰（CNBrCNBr）、环氧氯丙烷、）、环氧氯丙烷、 1,4-1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。 4. 4. 偶联（亲和吸附剂的制备）偶联（亲和吸附剂的制备） 溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。 如用如用CNBr CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基作用于葡聚糖和琼脂糖的

42、糖羟基 2）引入连接臂）引入连接臂（space arm） 又称手臂（又称手臂（spacer ） “接臂接臂” 的目的：的目的： 克服克服影响配基与生物大分子影响配基与生物大分子 的结合的的结合的空间障碍空间障碍。 “接臂接臂”的途径：的途径： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如： AH-Sepharose 4BAH-Sepharose 4B 1） 层析前：层析前：制备亲和层析剂制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性根据欲分离物质特性 配基配基 选择 根据配

43、基分子大小及基团特性根据配基分子大小及基团特性 载体载体 2）洗脱：）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱包括：非专一性洗脱和专一性洗脱 偶联 亲和层析剂亲和层析剂 5. 操作：操作： 非专一性洗脱：非专一性洗脱： 改变温度改变温度 改变改变pH值值 改变离子强度改变离子强度 专一性洗脱：专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制竞争性洗脱剂（半抗原、抑制 剂、底物类似物）剂、底物类似物） 被吸附物质结合被吸附物质结合 竞争性地与竞争性地与 配体结合配体结合 1）纯化大分子物质）纯化大分子物质 如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地

44、结合碳如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳 水化合物的蛋白质），水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B 2) 研究酶的结构与功能：研究酶的结构与功能： 分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。 6. 应用应用 ( (六六) ) 高效（压）液相层析高效（压）液相层析 （HPLCHPLC：High PerformanceHigh Performance（pressurepressure） Liquid Chromatography Liquid Chromatography ） 特点：特点： 使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大使用的固相

45、支持剂颗粒很细，表面积很大, , 因而分辨率很高。因而分辨率很高。 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 固定相（柱填料）：固定相（柱填料）： 常用常用坚硬、耐高压，粒度小坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。的硅胶。 流速为240ml/hr 颗粒大小为5080目。 洗脱体积（洗脱体积（ml） HPLC是利用样品中的溶质在固定相和是利用样品中的溶质在固定相和 流动相之间分配系数的不同，进行连续的无流动相之间分配系数的不同，进行连续的无 数次的交换和分配而达到分离的过程。数次的交换和分配而达到分离的过程。 许多类型的柱层析都可用许多类型的柱层析都可用HPLCHPLC来代

46、替，来代替， 如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。 1. 基本原理基本原理 按溶质（样品）在两相分离过程的物理按溶质（样品）在两相分离过程的物理 化学性质分类：化学性质分类： 亲和色谱：亲和色谱： 亲和力亲和力 吸附色谱：吸附色谱： 吸附力吸附力 离子交换色谱：离子交换色谱： 离子交换能力离子交换能力 凝胶色谱：凝胶色谱： 分子大小而引起的体积排阻分子大小而引起的体积排阻 分配色谱：分配色谱： 分配系数分配系数 2. 分类分类 分配色谱又可分为：分配色谱又可分为： 正相色谱：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱

47、：反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。固定相为非极性，流动相为极性。 用的最多，约占用的最多，约占6070。 固定相：固定相：硅胶硅胶填料是非极性的，官能团为烷烃。填料是非极性的，官能团为烷烃。 流动相组成流动相组成 ：常用常用“甲醇甲醇H2O” 。 反相色谱中，蛋白质按其疏水性大小进反相色谱中，蛋白质按其疏水性大小进 行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不 易与非极性的固定相结合，先被洗脱下来。易与非极性的固定相结合，先被洗脱下来。 即：随着甲醇梯度的增加而洗脱出疏水即：随着甲醇梯度的增加而洗脱出疏水 性越来越强的蛋白质。性越来越强的蛋白质。 3.

48、色谱仪组成色谱仪组成 1）进样系统）进样系统 2）输液系统）输液系统 3）分离系统）分离系统 4）检测系统）检测系统 5）数据处理系统）数据处理系统 Gel Filtration Ion Exchange Hydrophobic Interaction Affinity Reversed Phase 层析技术层析技术结束情况结束情况起始条件起始条件 小量样品小量样品 低离子强度低离子强度 高离子强度或高离子强度或pH 改变改变 高离子强度高离子强度 低离子强度低离子强度 特异性结合特异性结合 特异性洗脱特异性洗脱 样品稀释，缓冲液不变样品稀释，缓冲液不变 习题 1.1. 比较吸附层析、疏水层析

49、、离子交换层比较吸附层析、疏水层析、离子交换层 析、凝胶过滤、亲和层析析、凝胶过滤、亲和层析 在原理、层析介在原理、层析介 质、操作及应用方面的异同点。质、操作及应用方面的异同点。 2.2. HPLC HPLC的产生特点及反向色谱的含义及分的产生特点及反向色谱的含义及分 离依据。离依据。 第七节第七节 电泳电泳 电泳电泳（electrophoresis, EPelectrophoresis, EP） ： 指带电粒子在电场中向着与其所带电指带电粒子在电场中向着与其所带电 荷性质相反的电极方向移动的过程。荷性质相反的电极方向移动的过程。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场电泳技术是根据各种带电粒子在

50、电场 中迁移速度的不同而对物质进行分离的实中迁移速度的不同而对物质进行分离的实 验技术验技术。 一、电泳的基本理论一、电泳的基本理论 1. 1. 原理原理: : 在一定在一定pHpH条件下（用条件下（用bufferbuffer），不同大小、），不同大小、 形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用 迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形 成紧密的泳动带。成紧密的泳动带。 + - ）带电粒子在电场中移动的方向）带电粒子在电场中移动的方向 带电粒子在电场中移动的方向决定于带电粒子在电场中移动的方向决定于 所带电荷的种类

51、，带正电荷的粒子所带电荷的种类，带正电荷的粒子 向电场向电场 的阴极移动，带负电的粒子向电场的阳极的阴极移动，带负电的粒子向电场的阳极 移动，净电荷为零的粒子在电场中不移动。移动，净电荷为零的粒子在电场中不移动。 迁移率：带电粒子在单位电场强度下的泳迁移率：带电粒子在单位电场强度下的泳 动速度，可用下式表示：动速度，可用下式表示： = v/E= v/Ev v颗粒的泳动速度颗粒的泳动速度cm/scm/s E- E-电场强度电场强度V/cmV/cm - -迁移率迁移率cmcm2 2/V.s/V.s ）带电粒子在电场中的移动速度）带电粒子在电场中的移动速度 泳动速度与内在特性和外界条件有关泳动速度与

52、内在特性和外界条件有关 内在特性内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状） 外界条件外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性：电场强度、溶液性质、支持体特性 将带净电荷将带净电荷Q Q的粒子放入电场，受到的电场引力为：的粒子放入电场，受到的电场引力为： F F引 引=EQ =EQ 在溶液中在溶液中, ,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F F阻 阻 F F阻 阻 = 6rV = 6rV 当当F F引 引=F =F阻 阻时 时 EQ = 6rVEQ = 6rV EQ EQ V = V = 6r 6r E E电场强度电场强度 (V/cm)

53、 q(V/cm) q带电粒子的电荷带电粒子的电荷 r-r-粒子的半径粒子的半径 -溶液的黏度溶液的黏度 1）颗粒性质：）颗粒性质： Q越大、越大、r 越小、形状越接近球形，越小、形状越接近球形，v 越快。越快。 2）电场强度：）电场强度：E越高，越高，v越快。越快。 3）溶液性质：）溶液性质： pH值：离值：离pI越远，越远，v越快。（用越快。（用buffer保持恒定）保持恒定） 离子强度：离子强度越高，离子强度：离子强度越高，v 越低。越低。 原因：离子氛原因：离子氛(云）（云）（ionic atmosphere）。）。 通常，缓冲液离子强度在通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。之间

54、。 4）电渗：）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 应避免用高电渗物质作支持介质。应避免用高电渗物质作支持介质。 ）影响泳动速度的因素：）影响泳动速度的因素： EQEQ V = V = 6r 6r 自由界面电泳：又称移动界面电泳自由界面电泳：又称移动界面电泳（moving moving boundary electrophoresis, MBEPboundary electrophoresis, MBEP），指在，指在 没有支持介质的溶液中进行的电泳。没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳区带电泳: :（zone electrophore

55、sis, ZEPzone electrophoresis, ZEP） 指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介 质上分离成若干区带。质上分离成若干区带。 支持介质的作用支持介质的作用: :防止电泳过程中的对流和扩散。防止电泳过程中的对流和扩散。 2. 电泳的分类电泳的分类 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的 定性定量分析。定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清 蛋白、胎盘

56、球蛋白，优点是简便迅速，便于保存蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存 照相，比纸电泳分辨率高。照相，比纸电泳分辨率高。 v以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度 大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的 电荷多少进行分离。电荷多少进行分离。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较 大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳： 可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨

57、可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨 率较高。率较高。 v聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺和和琼脂糖琼脂糖是目前实验室最常用的支是目前实验室最常用的支 持介质。持介质。 3. 电泳常用设备电泳常用设备 （1）电泳仪）电泳仪 ：为电泳提供稳定直流电源的装置为电泳提供稳定直流电源的装置 。 常压电泳仪（常压电泳仪（600V600V） 高压电泳仪（高压电泳仪（3000V3000V） 超高压电泳仪（超高压电泳仪（30000V30000V50000V50000V） （2 2）电泳槽：）电泳槽： 自由界面电泳槽自由界面电泳槽 管状电泳槽管状电泳槽 板状电泳槽板状电泳槽 （3 3）附属设备：）附属设备： 水平板式

58、电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide polyacrylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，PAGEPAGE）是以聚丙烯酰）是以聚丙烯酰 胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体 （acrylamideacrylamide，简称，简称AcrAcr）和交联剂）和交联剂N N，N-N- 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（methyla

59、ne bisacrylamidemethylane bisacrylamide， 简称简称BisBis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。）在催化剂和加速剂作用下聚合的。 1.原理原理 CHCH2 2=CH=CH C=OC=O NHNH2 2 CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH -CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O -CH-CH2 2-CH-

60、CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2 丙烯酰胺丙烯酰胺 N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1 1）化学催化系统：）化学催化系统：AP-TEMEDAP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfateammonium persulfate，APAP） 加速剂：加速剂：TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺） 2 2）光催