分子生物学实验手册-高校教材

1、生物工程与技术基础实验与工程实训中心分子生物学实验室实验一氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验二 细菌质粒DNA的提取实验三琼脂糖凝胶电泳实验四 细菌基因组DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳实验五 质粒DNA限制性内切酶实验实验六 聚合酶链式反应（PCR ）扩增目的基因实验七 胶回收法纯化DNA与琼脂糖凝胶电泳南京工业大学制药与生命科学学院分子生物学实验教学大纲英文名称：Molecular biology学分：1 学时：32教学对象：生物工程专业、制药工程专业、药剂学专业、食品学专业、生物技术 专业教学目的：在开设的理论课程的基础上，结合实验课程的教学，使学生能较全而 系统的掌握分子生物学的基

2、本操作，拓宽专业知识面，加深对专业知识的理解， 强化动手能力。基本要求：了解分子生物学的实验操作原理，掌握有关实验仪器的使用方法。实验内容：实验一.细菌质粒DNA的提取及酶切实验（8学时）基本耍求：通过学习碱变性抽提法对大肠杆菌中的质粒的抽提，掌握质粒DNA的小量 制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。进一步了解限制性 内切酶的特性及酶切反应过程，掌握DNA的酶切技术。重点：掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。进一步 了解限制性内切酶的特性，掌握DNA的酶切技术。难点：掌握质粒DNA的小量制备方法及DNA的酶切技术。实验二.细菌基因组DNA的提取（4学时）基本

3、耍求：了解细菌基因组DNA的提取的目的，原理，掌握细菌基因组DNA的提取的实 验步骤及操作方法重点：掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法难点：掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法实验三.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验（4学时） 基本耍求：了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过 程，掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。重点：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术难点：小大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验四.聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因及晾脂糖凝胶电泳 （8学时） 基本耍求：熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；

4、了解PCR反应条件 的优化和注意事项和应用范围 掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核 酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。重点：掌握掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。难点：聚合酶链反应（PCR）的实验技术，琼脂糖凝胶电泳的实验方法。实验五.聚内烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质 （4学时） 基本耍求：了解聚内烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本原理，学会用该法 测定蛋白质分子量的操作技术。重点：掌握聚内烯酰氨凝胶的配制方法，了解聚内烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分 离蛋白质的基本步骤及实验结果的判定 难点：八聚内烯酰氨凝胶电泳的实验步

5、骤及实验结果的判定实验一氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验目的掌握重组DNA质粒转化至大肠杆菌宿主的操作技术。实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量 复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2, RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞 膜的通透性发生变化，能容许外源DNA的载体分子通过。大肠杆菌形态图实验步1感受态细胞的制备：1）挑菌37C培养。2）将过夜培养的细菌转接培养2-3小时。3）将菌液置冰上10分钟,4C离心SOOOrpm 30秒。4）用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去

6、上清。5）氯化钙溶液悬浮菌体。2转化：1）取出感受态细胞，试剂A,无菌双蒸水和待转化的质粒DNA,均置冰盒内。2）取离心管管一支，将质粒、试剂A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴20分钟。3）在管内加入400ul LB液体培养基,振荡培养10-40分钟。4）涂布培养。实验二质粒DNA的提取实验目的本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒PET-22b的 抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的基本原理。 实验原理载体是基因工程所必需的工具，它用丁将目的基因运载到宿主细胞内进行克隆与表达。常用的载体有质粒、入噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA和昆虫病毒DNA

7、等，而质粒是最常用的载体。MCt质粒图谱1质粒图谱2质粒电泳图实验步骤1收集菌泥。2悬浮细菌。3加入200 u 1裂解液(Solution 2),充分裂解菌体。4 加入 400 P 1 絮凝剂(Solution 3)。5 15000rpm离心10分钟，无需低温离心。6将步骤5中的上清转移到吸附柱(3S)中， 12000rpm离心1分钟。7将吸附柱放入同一支收集管中，吸取洗涤液到吸附 柱，离心1分钟。8重复步骤7 一次。9将吸附柱放入同一支收集管中，高速离心2分钟。10在吸附柱(3S)膜中央加50U1无菌双蒸水，室温高速离心1分钟。实验三琼脂糖凝胶电泳实验目的用来检测DNA的情况，如DNA片段分

8、子量的大小、纯度等。实验原理利用晾脂糖凝胶电泳相对丁标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相对分子 量。一般SOObp以上的片段用08%的琼脂糖凝胶，800bP以下的片段，用10%-20% 的琼脂糖凝胶。用澳化乙锭染色，在紫外灯下可以H接确定并分析DNA片段在凝 胶板中的迁移率。实验步骤：1将配好的电泳缓冲液，倒入电泳槽。2将晾脂糖凝胶放入微波炉熔化。3熔化后的晾脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中。4静置1小时左右，等琼脂糖凝胶凝固后垂氏拔去梳子。5将晾脂糖凝胶放入电泳槽中。6点样，一般上样量为10 X Loading Buffer 05-1 P 1. DNA样品（质粒）3p 1混 匀，点入凝胶孔内

9、。7质粒电泳参数：电泳仪的电压100V,电流500mA,功率250W。电泳时间40分 钟。8将晾脂糖凝胶取出，放入紫外与可见分析装置。9凝胶成像系统显像，拍照。电泳图凝胶成像系统实验细菌基因组DNA的提取实验目的本实验通过利用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒对大肠杆菌基因组DNA的抽 提，掌握细菌基因组DNA的小量制备方法。实验原理细菌基因组DNA的结构本实验使用溶菌酶破權及蛋白酶K消化以确保基因组DNA得率。不使用苯 酚/氯仿等有机试剂，无须传统的乙醇沉淀、洗涤、干燥、溶解过程，简化了操 作。大肠杆菌的细胞的结构实验步骤1细菌的消化2加入400ulDL液和25 ul蛋白酶K,迅速温和地來回颠倒

10、离心管彻底混匀。 温浴30分钟。离心1分钟后，取上清至另外一个离心管中。3加入200 ul异内醇，离心弃去收集管中的液体。4加入500 ul洗涤液，离心30秒。5将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。离心15秒。6将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。7在吸附膜中央加入100 ul T1、液,离心1分钟。将DNA -20 C保存。8取纯化后基因组片段洗脱液2P1加上样缓冲液1U1混匀，标准分子量DNA2-3P 1,电泳检测结果。实验五 质粒DNA限制性内切酶实验实验目的通过DNA限制性内切酶实验掌握内切酶技术。实验原理不同酶切反应都需耍不同的酶切缓冲液。多数生物技术公司的产品目录中均 有关丁何

11、种限制性内切酶适合何种缓冲液的资料可供査阅。绝大多数酶的反应温 度是在37Co酶切反应时间有30分钟、60分钟,以至2小时以上甚至过夜。 本次实验耍进行的是对重组质粒PET-22b进行EcoRI酶切，重组质粒上有两个EcoRI识别位点。内切酶酶切DNA示意图内切酶酶切DNA立体示意图实验步骤1在离心管管中以编号次序加入以下相应试剂:(1)ddH2045 u 1(2)10X Buffer2u 1(3)BSA小牛血清25 u 1(4)质粒DNA10 u 1(5)EcoR IIn 1总体积20 u 12000bplOOObp TSOby SOOhp250bp lOObp2 37C水浴15小时后，终止

12、酶切反应。3取单酶切反应液10 y 1和上样缓冲液2u 1,混匀，标准分子量DNA 5ul,待作电泳上样液。琼脂糖凝胶电泳图4 08%的晾脂糖凝胶电泳。5紫外灯下观察酶切琼脂糖凝胶电泳图。实验目的实验六 重组DNA的PCR扩增学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理多聚酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两测和与其两测互补的两个寡核甘酸引物，经变性、退火和延伸后，DNA可扩增一实验步骤1在02ml离心管管内配制50 u L反应体系:(1)ddH2038 nL(2)lOXbuffer5n L(3)dNTPluL(4)Taq酶luL(5)引物PlluL(6)引物2l

13、uL(7)模板DNA3nL2按下列程序进行扩增:(1)94C预变性5分钟；(2)94C变性50秒;(3)55C退火50秒;(4)72C延伸10秒;(5)重复步骤-30次;(6)72C彻底延伸10分钟。3琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。200Obp lOOObp 750bp 500bp 250bp lOObp琼脂糖凝胶电泳图圈操作漩程简禺实验七胶回收法纯化DNA实验目的本实验利用胶回收纯化试剂盒从晾脂糖凝胶中将目的DNA片段进行抽提纯 化，从中掌握切胶技术以及回收目的DNA片段并纯化的方法。实验原理琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，可用于分离、鉴定和纯化DNA 片段。胶回收是指目的DNA片段

14、经由晾脂糖凝胶电泳与其它片段分离，再从琼脂 糖凝胶中将目的DNA片段抽提纯化出來的过程。实验步骤操作流程见右图1目的DNA电泳。2切出含有目的DNA的凝胶。3称量胶块重量，计算胶块体积。4向胶块中加入胶块融化液。5 75C加热融化胶块。6将溶液转移至Spin Column中离心1分钟，弃滤液。7 用 Rinse A, Rinse B 冲洗 SpinColumno8在Spin Column膜的中央处加入25 P 1的灭菌蒸镭水或ElutionBufferl2, 000 rpm离心1分钟洗脱DNAo9取胶回收目的基因片段洗脱液1P 1 加上 10X Loading Buffer 1 U1混匀。仪器

15、编号仪器名称型号单价厂家购置日期领用人存放地点20056176标准型双人SW-CJ-IC3490苏州净化设2005. 10刘洋笃行40720056177标准型双人SW-CJ-IC3490苏州净化设2005. 10刘洋笃行40720056127冰箱海尔 BCD-21I2320青岛海尔2005. 12刘洋笃行40720056023超声波细胞JY92-II2D11488宁波新芝公2005. 12刘洋笃行40720010674电热鼓风干:101C-33490苏州净化设2005. 12刘洋笃行40720051742电子天平BS224S6900北京赛多利;2005. 13刘洋笃行40720051743电子

16、天平BS224S6900北京赛多利;2005. 14刘洋笃行40720056016电子天平BS224S6900北京赛多利;2005. 15刘洋笃行40720056144电子天平BS224S6900北京赛多利;2005. 12刘洋笃行40720056146电子天平BS224S6900北京赛多利;2005. 12刘洋笃行40720051786隔水式恒温:PYX-DHS50012950上海跃进医2005. 03曹飞笃行40720051787隔水式恒温.PYX-DHS50012950上海跃进医;2005. 03曹飞笃行40784070001精密增力电;JJ-1510常州国华电2005. 10刘洋笃行4

17、0720051747冷藏柜海尔SC-3291900青陥海尔2005. 12刘洋笃行40720051750冷藏柜海尔SC-3291900青岛海尔2005. 12刘洋笃行40720054981酶标仪BTO-Rad 68(43000南京惠众医2005. 12周华笃行40720056017三温水浴锅DK-8D1460上海将宏实!2005. 12刘洋笃行40720056018三温水浴锅DK-8D1460上海将宏实!2005. 12刘洋笃行40720056019三温水浴锅DK-8D1460上海将宏实!2005. 12刘洋笃行40720056093温水浴锅DK-8D1565上海将宏实!2005. 12刘洋笃

18、行40720054980生物电泳图FR-98038000上海复日科2005. 12周华笃行40720056031手提式火菌?YXQ. SG41. 2(665上海医用核2004.12谢宁昌笃行40720056032手提式灭菌YXQ. SG41. 2(665上海医用核2004.13谢宁昌笃行40720056033手提式火菌?YXQ. SG41. 2(665上海医用核2004. 14谢宁昌笃行40784070002数控超声波KH2200DB1758昆山禾创超2005. 12刘洋笃行40784070003数显恒温水HH-2510常州国华电2005. 10刘洋笃行40784070001数显恒温水HH-2

19、510常州国华电2005. 10刘洋笃行40784070005数显恒温水HH-2510常州国华电2005. 10刘洋笃行40784070006数显恒温水HH-2510常州国华电2005. 10刘洋笃行40720055991双稳定时电:DDY-8C2079北京六-仪2005. 12刘洋笃行40720055993双稳定时电:DDY-8C2079北京六一仪2005. 12刘洋笃行40720056091双稳定时电DYY-11B2272北京六一2005. 12刘洋笃行40720055992双稳定时电:DYY-8C2272北京六一2005. 12刘洋笃行40720056050水浴恒温振DSHZ-300A5

20、850太仓市实验2005. 12刘洋笃行40720056089酸度计PHS-3C1739上海精密科2005. 12刘洋笃行40720056134酸度计PHS-3C1593上海错磁仪2005. 12刘洋笃行40720056047台式低温振THZ-C-110350太仓市实验2005. 12刘洋笃行40720056048台式低温振THZ-C-110350太仓市实验2005. 12刘洋笃行40720056086台式离心机TGL-16B1825上海安亭科2005. 12刘洋笃行40720056087台式离心机TGL-16B1825上海安亭科2005. 12刘洋笃行40720056088台式离心机TGL-

21、16B1825上海安亭科2005. 12刘洋笃行40720056158台式离心机TGL-16G2020上海安亭仪2005. 12刘洋笃行40720056159台式离心机TGL-16G2020上海安亭仪2005. 12刘洋笃行40720056160台式离心机TGL-16G2020上海安亭仪2005. 12刘洋笃行40720056161台式离心机TGL-16G2020上海安亭仪2005. 12刘洋笃行40720056162台式离心机TGL-16G2020上海安亭仪2005. 12刘洋笃行40720056163台式离心机TGL-16G2020上海安亭仪2005. 12刘洋笃行40720056164台

22、式离心机TGL-16G2020上海安亭仪2005. 12刘洋笃行40720050920梯度PCR仪*30982.5Eprendof公2005. 05周华笃行40720050921梯度PCR仪*30982.5Eprendof公2005. 05周华笃行40720056094制冰机SIM-F12431000SANYO2005. 12刘洋笃行40720058537紫外分光光丿UV-91003780北京瑞利分2001. 04王桂土笃行40720058538紫外分光光,UV-91003780北京瑞利分,2001. 04王桂土笃行40720051810紫外透射仪WFH-201B3980上海将科实2005.

23、08刘洋笃行40720031731紫外透射仪ZF-1765上海将科实2005. 12谢宁昌笃行40720056024紫外透射仪ZF-13100上海康华仪2005. 12刘洋笃行40720056025紫外透射仪ZF-13100上海廉华仪2005. 12刘洋笃行40720051794紫外透射仪ZF-5013100上海康华仪2005. 12刘洋笃行407分子生物学扌毘材低型烧杯耗材500ml5.25分子生物?26耗材1000ml9.88分子生物?78.4定性滤纸耗材12.5cm8. 662分子生物f17.2称量纸耗材75*757.51分子生物7. 5药勺耗材57分子生物?35敷料银耗材145. 12

24、分子生物?10.2耗材165.72分子生物?11.4耗材207.22分子生物14.4方盘耗材20*3010.816分子生物172.8塑料烧杯耗材1000ml810分子生物80无水乙醇耗材820分子生物?160洗衣粉耗材3.510分子生物35撮箕耗材175分子生物?85挂衣钩耗材2.820分子生物?56记事本耗材240分子生物80棉线耗材1110分子生物110不锈钢药丿耗材2.84分子生物?11.2牙签耗材120分子生物?20胶带耗材4.510分子生物?45拖把耗材65分子生物30塑料垃圾耗材5.510分子生物55电水壶耗材851分子生物?85肥皂盒耗材2.615分子生物?39扫帚耗材65分子生

25、物?30塑料垃圾彳耗材16.720分子生物334低型烧杯耗材50ml3. 1610分子生物31.6耗材250ml3.715分子生物55. 5耗材500ml5. 1515分子生物?77.25耗材1000ml9.7112分子生物116. 5三角烧瓶耗材100ml3.420分子生物?68耗材250ml4.420分子生物?88耗材500ml6. 456分子生物38. 7耗材1000ml116分子生物66培养皿耗材90cm2.6120分子生物?312酒精灯耗材2503.510分子生物?35铸铁电炉耗材2000w552分子生物?110天平耗材10001172分子生物234纱布耗材500g2810分子生物?

26、280垃圾袋耗材1120分子生物：220白大口瓶耗材125ml35分子生物15耗材250ml3.510分子生物?35耗材500ml4.610分子生物?46棕大口瓶耗材125ml4.51分子生物?18抽纸耗材6.52分子生物13塑料洗瓶耗材500ml4.54分子生物?18胶带耗材2cm1.510分子生物?15塑料卷纸f耗材5.520分子生物?110取液器耗材QY-2002802分子生物?560肥皂盒耗材48分子生物32有机比色耗材50/12*1435分子生物?215接种棒耗材1010分子生物?100抹布耗材3*15.510分子生物?55塑料盆耗材5.810分子生物?580跖勺耗材2.82分子生物

27、5.6取液器耗材QY-lOOOu：3302分子生物?660耗材QY-102802分子生物560帆布手套耗材310分子生物?30洗洁净耗材3.510分子生物?35蔡酸手套耗材401310分子生物?130纱手套耗材2.510分子生物?25吸咀盒耗材200ul1030分子生物?300离心管盒耗材1.5ml1020分子生物?200吸咀盒耗材lOul1030分子生物?300塑料离心耗材0. 5ml0. 0810000分子生物?800耗材0. 2ml0. 065000分子生物?300耗材1.5ml0. 110000分子生物1000吸咀耗材lOOOul0. 15000分子生物?500耗材200ul0. 0410000分子生物：400耗材lOul0. 0410000分子生物400三角烧瓶:耗材250ml8.810分子生物?88试管刷耗材小0.820分子生物?16耗材中120分子生物?20三角烧瓶丄耗材2.510分子生物25平皿刷耗材2.520分子生物?50试管刷耗材大1.520分子生物?30吸耳球耗材中2.84分子生物?11.2洗手液耗材152分子生物?30胶带耗材1CM1.510分子生物15三角漏斗耗材75mm2.910分子生物?29双而架耗材1040分子生物