环状RNA hsa_circ_0000400在原发性结肠癌中的表达水平及其临床诊断意义临床医学专业

1、环状RNA hsa_circ_0000400在原发性结肠癌中的表达水平及其临床诊断意义摘要：目的：探讨结肠癌患者血清中环状RNA hsa_circ_0000400的表达水平及临床诊断意义，以及hsa_circ_0000400作为结肠癌诊断生物标志物的可行性。方法：培养结肠癌标准细胞株SW480,LOVO与正常人结肠粘膜上皮细胞株HCoEpiC，选取常熟市第二人民医院收治的结肠癌患者肿瘤组织56例，相应癌旁组织56例，结肠癌患者血清78例，同期健康体检者血清78例，采用实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术检测结肠癌标准细胞株SW480,LOVO与正常人结肠粘膜上皮细胞株HCoEpiC

2、，结肠癌肿瘤组织及相应癌旁组织，以及结肠癌患者与健康人血清hsa_circ_0000400相对表达水平，并结合患者年龄、性别、临床分期、是否有淋巴结转移等临床病理特征综合分析。用受试者工作特征曲线（ROC）评价hsa_circ_0000400对于结肠癌的诊断效能。结果：结肠癌标准细胞株LOVO，SW480中的hsa_circ_0000400相对表达量明显高于人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC，差异具有统计学意义（P0.05）。结肠癌患者肿瘤组织中hsa_circ_0000400的相对表达量升高，明显高于对应的癌旁组织，差异具有统计学意义（P0.05）。结肠癌患者血清中hsa_circ_0000

3、400的相对表达量明显高于健康人血清，差异有统计学意义（P0.05），hsa_circ_0000400表达与肿瘤TNM分期，分化程度及是否有淋巴结转移均有关（均P0.05）。单独使用hsa_circ_0000400作为诊断标志物时，ROC曲线下面积0.888，临界值为4.185，敏感性0.833，特异性0.808。hsa_circ_0000400联合CA19-9作为诊断标志物时，ROC曲线下面积增加至0.945，敏感性0.833，特异性0.974。结论： hsa_circ_0000400可作为一种新的结肠癌诊断生物学标志物，与CA19-9联合检测，在结肠癌的诊断中起到一定的价值。结肠癌（col

4、orectal cancer,CRC）是最常见消化道的恶性肿瘤之一，多好发于乙状结肠与直肠交汇处，近年来,结肠癌的发病率与死亡率逐渐上升，尽管结肠癌的临床诊疗技术取得了重大进展,但由于其早期症状不明显，依靠临床症状诊断并不能在第一时间发现肿瘤。而寻常的诊断方法如CT,MRI，X线，CEA,CA19-9等特异性较差，不能第一时间判断结肠癌的相关情况，因此有必要寻找一种新的生物学标志物，探索影响结肠癌进展的机制。环状RNA是一种拥有独特环状结构的内源性非编码RNA， circRNA没有5端帽子和3端poly(A)尾，通过共价键形成闭合的环状结构，使它能够耐受RNA酶的降解，因此circRNA极其稳

5、定。此外，circRNA在不同物种中具有高度的保守性，其大量存在细胞质中，且在血液、唾液、外泌体中也能检测到丰富的circRNA，近年来越来越多的研究证实, circRNA与肿瘤的发生发展有关,并在肿瘤进展过程中能够发挥重要的作用。这种特性使得circRNA成为较理想的疾病诊断的生物标志物。本研究参考了目前已发表的circRNA，并结合circRNA数库circBase，选定了与结直肠癌相关的一种circRNA分子，即hsa_circ_0000400。旨在研究结肠癌组织、标准结肠癌肿瘤细胞株以及结肠癌病人血清中的表达情况与其对照组的表达差异，并验证其作用机制，探讨其成为新的结肠癌诊断生物学标志

6、物的可行性。1.材料与方法1.1临床标本1.1.1组织标本：收集常熟市第二人民医院普外科2016年1月至2019年12月收治的56例结肠癌患者，所有患者未经化疗、放疗或靶向药物治疗。每例标本分别取癌组织及癌旁正常组织（距离癌组织3厘米），组织标本取出后用TRIzol浸泡后立即放入-80冰箱保存。患者病理切片均经常熟市第二人民医院病理科专家诊断为结肠癌，有完整的临床病理记录。56例病例中，男31例，女25例；年龄小于60岁21例，大于等于60岁35例；TNM分期期14例，期42例；高、中分化41例，低分化15例。所有患者在获取标本前，均已签署患者知情同意书。1.1.2血液标本：收集常熟市第二人民

7、医院普外科2018年1月至2020年10月收治确诊的78例结肠癌患者，78例病例中，男42例，女36例；年龄小于60岁32例，大于等于60岁46例；TNM分期期25例，期53例；高、中分化52例，低分化26例。所有患者均未接受过任何治疗，在手术前一天清晨采血5ml。对照组标本随机选取自2020年9月在常熟市古里中心卫生院参加健康体检的人群。血液样本置于肝素抗凝管中，采用TRIzol法提取血样中总RNA。1.2细胞株及细胞培养人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC，结肠癌SW480，LOVO标准细胞株均购自浙江如耀生物科技有限公司。采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养。1.3主要试

8、剂仪器hsa_circ_0000400和Human/Mouse 18S引物购自上海新贝生物科技有限公司，Trizol试剂购自美国Thermo公司，HiScript II Reverse Transcriptase逆转录试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，Nano Drop 1000分光光度计购自美国Thermo公司，7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，CL-6000i全自动化学发光免疫分析仪购自深圳迈瑞公司。1.4RNA提取和QPCR使用Trizol法提取测定样本的总RNA，用Nano Drop 1000分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，选择

9、260nm/280nm处吸光度值为1.82.0的RNA标本，用HiScript II Reverse Transcriptase逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录合成cDNA。反应体系为20L，反应条件：42 3 min，60 15 min，85 5min。以cDNA为模板，SYBR Green PCR试剂盒检测表达水平。反应体系为10L，反应条件：95预变性5min，95 10 S，60 30 S，共40个循环。以Human/Mouse 18S为内参，以2-Ct表示相对表达量。hsa_circ_0000400 F：ACTTACCTCGACTCTTAGCTTGTCG，R：GGTCTTGTCACT

10、TGGCATCTGG，Human/Mouse 18S F：GAACGAGACTCTGGCATGCTA，R：CACGCTGAGCCAGTCAGTGTA1.6血清CA19-9检测采用迈瑞CL-6000i全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂检测血清CA19-9。1.7统计学分析 采用SPSS 23.0统计学软件进行处理。所有数据采用均数标准差标识，两组间比较采用t检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线评价hsa_circ_0000400的诊断效能。以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1 hsa_circ_0000400在结肠癌

11、标准细胞株SW480,LOVO及人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC中的表达比较 QPCR检测结果显示，在结肠癌标准细胞株SW480，LOVO及人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC中，hsa_circ_0000400的相对表达量分别为315.5223.53,95.0412.06和0.810.25， hsa_circ_0000400在结肠癌标准细胞株中的表达高于人正常结肠上皮细胞株，差异具有统计学意义（P0.05），见图1。2.2 hsa_circ_0000400在结肠癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达比较QPCR检测结果显示，56例结肠癌患者肿瘤组织以及癌旁正常组织中的hsa_circ_0000

12、400相对表达量分别为10.194.00和4.421.66，hsa_circ_0000400在结肠癌肿瘤组织中的表达高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（P0.05），见图2。2.3 hsa_circ_0000400在结肠癌患者血清及健康人血清中的表达比较QPCR检测结果显示，在结肠癌患者血清及健康人血清中hsa_circ_0000400的相对表达水平分别为7.343.40和2.621.09，hsa_circ_0000400在结肠癌患者血清中的表达高于健康人，差异有统计学意义（P0.05），见图3。图1 hsa_circ_0000400在结肠癌标准细胞株SW480,LOVO及人正常结肠上皮细胞

13、株HCoEpiC中的表达情况图2 hsa_circ_0000400在结肠癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达情况图3 hsa_circ_0000400在结肠癌患者血清及健康人血清中的表达情况2.4结肠癌患者肿瘤组织中hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系结肠癌患者肿瘤组织中hsa_circ_0000400表达水平与TNM分期，分化程度及淋巴结转移均有关（均P0.05），见表1。2.5结肠癌患者血清hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系结肠癌患者血清hsa_circ_0000400表达水平与TNM分期，分化程度及淋巴结转移均有关（均P0.05），见表2。表1：

14、56例结肠癌患者组织hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系( xS)表2：78例结肠癌患者血清hsa_circ_0000400水平与临床病理特征的关系( xS) 2.5血清hsa_circ_0000400的相对表达量对结肠癌的诊断效能通过ROC曲线分析，单独使用hsa_circ_0000400作为结肠癌患者和健康人的诊断指标时，临界值为4.185，曲线下面积（area under curve,AUC）为0.888，敏感性0.833，特异性0.808。若联合CA19-9联合诊断，ROC曲线下面积增加至0.945，敏感性0.833，特异性0.974。见图4图4 hsa_circ_

15、0000400的ROC曲线以及hsa_circ_0000400联合CA19-9的ROC曲线3讨论结肠癌是临床最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来，其发病率呈不断上升趋势。尽管在结肠癌的临床诊疗上有着巨大的进展，但由于其初期症状不明显，且现有常规检测方法敏感度较低，许多患者在发现时已有转移。因此，寻找一种新型生物学标志物，提高结肠癌的初期诊断率，是当前结肠癌研究中迫切需要解决的重大问题。circRNA是一种新型的RNA分子，通过反式剪接使5端帽子和3端poly(A)尾通过共价键形成闭合的环状结构，其结构十分稳定，并且大量存在于细胞质中，且在血液、唾液、外泌体中也能被检测到。目前认为circRNA主

16、要作为“miRNA海绵”，通过竞争性结合miRNA，参与肿瘤的发生发展。现有研究表明，circRNA在癌症中异常表达，且与癌症的发生，发展、转移等密切相关。Li Bo等研究发现，circRNA BCRC4通过调节microRNA-101从而抑制ECH2在RNA和蛋白水平上的表达，在膀胱癌的鉴定和治疗中提供了一条新的思路。Chi Hin Wong等研究发现，circFOXK2在胰腺导管腺癌患者中明显上调，通过与YBX1和hnRNPK复合可以促进胰腺导管腺癌的发展。Zheng等研究发现，circSEPT9在三阴性乳腺癌组织中表达增高，且与临床进展及不良预后呈正相关。本研究结果显示，通过实时荧光定量

17、PCR法检测结肠癌组织、结肠癌标准细胞株以及结肠癌患者血液hsa_circ_0000400相对表达量均明显高于其对照组，结果有统计学意义（P0.05），提示hsa_circ_0000400可能作为促癌基因发挥作用，促进结肠癌的发生发展与转移，且与患者TNM分期、肿瘤分化程度、以及是否淋巴转移有关，而与患者的性别、年龄、肿瘤部位等无关。因此，检测患者血液hsa_circ_0000400表达量有望成为结肠癌诊断和预后评估的新型生物学标志物。现如今，CA19-9已被用于临床结肠癌的诊断，但是长链非编码RNA与其相比更具优势，在以往的一系列研究中，Li NA研究发现，CircTNL1XR1通过靶向调控miR-424/Smad7通路调控结肠癌的发展。胡洪林等研究发现，LncRNA RP5-1185K9.17高表达的患者的总生存时间及中位生存时间均较低表达者明显缩短，LncRNA RP5-1185K9.17是结肠癌患者预后不良的影响因子。陈澄亮等研究发现，结肠癌患者组织中高表达量的circ_001947和ADAM19mRNA与患者淋巴结转移和病理分期密切相关，检测circ_001947和ADA