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文档简介

1、 肝脏细胞悬液制备门静脉穿刺，以10mlmin流量经门静脉灌注pbs ，直至肝脏呈黄白色，总量约20ml。再用20ml 0.05的型胶原酶溶液(sigma ，pbs液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。取下肝脏加入20ml 0.05胶原酶，37 oc孵育40 min，经200目细胞筛过滤。pbs稀释至50ml, 300g 5 min，4oc，离心洗涤2次，取沉淀pbs稀释至50ml，用50gg 3min, 4oc离心，弃沉淀，将上清液以300g，5min, 4oc离心，取沉淀。 用镊子划碎肝组织装入试管消化 肝脏消化吹打后细胞悬液 细胞悬液过滤 洗涤与肝细胞沉淀 梯度离心percoll原液9份

2、加入1份pbs（10倍浓度）配成100%的sip。取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 ml 50的sip，然后倾斜（60o）试管，轻轻的沿着管加2ml25的sip细胞悬液（小鼠2管，大鼠4管）。500g，离心15 min，4oc， 50的sip和25的sip层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用pbs离心清洗2遍，弃上清(300g，5min)。 非肝细胞sip离心准备 sip离心后细胞层与洗涤 细胞贴壁 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。取出培养板，用37的pbs液轻轻冲洗3次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的kcs。刚分离出的细胞 kcs的培养方法培养 5co2、37、95湿度。换液间隔时间为2d。培养基配方为dmem（h）+双抗+10%胎牛血清（hyclone）。 2天及3天kcs 2周及3周kcs kcs的鉴定活力判定 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的24孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 f4/80免疫荧光鉴定kcs（小鼠）， cd163免疫组化鉴定kcs（大鼠）,阳性为kcs。 kcs 吞墨图像与台盼蓝拒然图片f4/80的免疫荧光和cd163免疫细胞化学(x400)致谢 感谢

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