最新：激光共聚焦与流式细胞及电生理技术荧光原理与激光共聚焦显微镜文档资料

1、con-focal and multi-photon microscope experiment fundamental果蝇大脑表达绿果蝇大脑表达绿色荧光蛋白细胞色荧光蛋白细胞光的基本知识光的基本知识一、光的本质：一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式 光的波长越长，光子的能量越小光的波长越长，光子的能量越小 光波光波 波长波长射线 10-510-3nmx线 10-40.1nm远紫外 10 20nm紫外 200400nm可见光 400760nm红外 0.7650m远红外 501000m微波 0.1100cm无线电波 1100m波长波长: :电

2、磁波波形上相邻的两个波峰或波谷之间的距离，一电磁波波形上相邻的两个波峰或波谷之间的距离，一般以纳米为单位。般以纳米为单位。频率频率: :每秒通过空间上一给定点的电磁波的个数，一般以每秒通过空间上一给定点的电磁波的个数，一般以 hz hz 为单位。为单位。光传播的速度光传播的速度: 30 : 30 万公里秒万公里秒光速光速= =波长频率波长频率波长和频率是成反比的关系，即：波长减小，频率增加。波长和频率是成反比的关系，即：波长减小，频率增加。波长波长振幅振幅 二二. . 光的性质：光的性质： 粒子性粒子性 光子（光量子）光子（光量子） 波动性波动性 光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形

3、振动光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动波长波长 光的颜色光的颜色振幅振幅 光的亮度光的亮度波长长（频率低）波长长（频率低） 光子能量小光子能量小波长短（频率高）波长短（频率高） 光子能量大光子能量大 = c / e = h = hc/ （h:h:普朗克常量）普朗克常量）光子具有能量，光子的能量与频率成正比，与波长成反比光子具有能量，光子的能量与频率成正比，与波长成反比可见光是人眼可以感受到的光，可见光是人眼可以感受到的光，只占整个电磁波波谱中波长从只占整个电磁波波谱中波长从400 400 纳米到纳米到 750 750 纳米的很小纳米的很小一部分。一部分。低于低于 400 400

4、 纳米的部分是紫外光，纳米的部分是紫外光，高于高于 750 750 纳米的部分是红外光。纳米的部分是红外光。反射反射折射折射衍射衍射振动方向一致的光在空间相遇会发生干涉振动方向一致的光在空间相遇会发生干涉相位相同的光发生相长性干涉，相位相反的光发生相消性干涉。相位相同的光发生相长性干涉，相位相反的光发生相消性干涉。三三. . 光的吸收光的吸收光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子所所吸收吸收。物质吸收能量后进入物质吸收能量后进入激发态激发态，当物质从激发态回到基态时，当物质从激发态回到基态时，以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的

5、能量以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量发射光发射光。光的吸收具有选择性光的吸收具有选择性 一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收 滤光片滤光片 吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过（一）荧光（一）荧光 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光高能状态，再回到低能状态时释放出的光 荧光是冷光，颜色为荧光是冷光，颜色为蓝蓝、绿绿、红红和和黄色黄色三三. .荧光的基本知识荧光的基本知识2. 2. 荧光产生的原理荧光产生的

6、原理荧光过程：荧光过程：u光子激发过程（飞秒数量）：位于基态的电子吸收光子的能量跃迁至不同的激发态能级；u振动松弛过程（皮秒数量级）：位于不同激发态能级的电子振动松弛到第一激发态的最低振动能级；u光子发射过程（纳秒数量级）：电子从第一激发态的最低振动能级回到基态释放出一个波长较长的光子；u虽然整个分子的激发态寿命，只有百万分之一秒的时间，但对于荧光光谱技术和荧光显微镜技术来讲，已经足够用于分析光与物质的相互作用。高灵敏的发射光谱、高空间分辨率和高特异性使得荧光技术成为遗传学和细胞生物学的重要研究工具。jablonski jablonski 能级图来说明荧光过程：能级图来说明荧光过程：电子的基态

7、轨道和第一、第二激发态轨道。粗线条代表轨道的能级，细线条代电子的基态轨道和第一、第二激发态轨道。粗线条代表轨道的能级，细线条代表轨道的不同振动能级。直线箭头表示由于吸收光子或发射光子而导致的电子表轨道的不同振动能级。直线箭头表示由于吸收光子或发射光子而导致的电子跃迁，波浪线箭头表示由于内部转换或其它非发射过程造成的电子跃迁。跃迁，波浪线箭头表示由于内部转换或其它非发射过程造成的电子跃迁。光子能量被吸收的过程是光子能量被吸收的过程是一个全或无的过程：如果一个全或无的过程：如果被吸收的光子的能量大于被吸收的光子的能量大于一个简单的电子跃迁所需一个简单的电子跃迁所需的能量，则多余的能量通的能量，则多

8、余的能量通常被转换成振动能量或旋常被转换成振动能量或旋转能量；如果光子的能量转能量；如果光子的能量不够产生一次电子跃迁，不够产生一次电子跃迁，则光子不被吸收。则光子不被吸收。一种荧光分子只能吸收特定光谱的光，用较宽光谱的光一种荧光分子只能吸收特定光谱的光，用较宽光谱的光照射荧光分子，可以使电子跃迁发生于基态的所有振动照射荧光分子，可以使电子跃迁发生于基态的所有振动能级和激发态的所有振动能级之间，其中一些电子跃迁能级和激发态的所有振动能级之间，其中一些电子跃迁具有较高的发生几率，这些跃迁的总和就形成了分子的具有较高的发生几率，这些跃迁的总和就形成了分子的吸收光谱。吸收光谱。荧光分子吸收了一个光子

9、以后，随即会发生一系列具有不同几率的事荧光分子吸收了一个光子以后，随即会发生一系列具有不同几率的事件：几率最高的事件是电子振动松弛到第一激发态的最低振动能级：件：几率最高的事件是电子振动松弛到第一激发态的最低振动能级：这一过程发生在皮秒时间内，被称为内部转换或振动松弛过程。多余这一过程发生在皮秒时间内，被称为内部转换或振动松弛过程。多余的能量转化为热能被周围的溶剂分子吸收。的能量转化为热能被周围的溶剂分子吸收。几率次之的是荧光发射过程：即处于最低激发态位置的电子经历纳秒几率次之的是荧光发射过程：即处于最低激发态位置的电子经历纳秒的时间后回到基态，并发出一个一定能量范围的光子，形成发射光谱。的时

10、间后回到基态，并发出一个一定能量范围的光子，形成发射光谱。大多数荧光分子可以被重复地激发和发射很多次，大多数荧光分子可以被重复地激发和发射很多次，直至荧光分子被破坏直至荧光分子被破坏光漂白光漂白(photobleaching)(photobleaching)。同荧光发射过程相竞争的过程：同荧光发射过程相竞争的过程：激发态能量可以非发射的变成热能；激发态能量可以非发射的变成热能；激发态分子可以通过碰撞将能量以另一种非发射的形式激发态分子可以通过碰撞将能量以另一种非发射的形式传递给其它的分子传递给其它的分子淬灭淬灭(quenching)(quenching)；无论那种荧光，其发光机理是相同的无论那

11、种荧光，其发光机理是相同的由光激发的荧光由光激发的荧光 光致荧光光致荧光由化学反应引起的荧光由化学反应引起的荧光 化学荧光化学荧光由由x x射线引起的荧光射线引起的荧光 x x射线荧光射线荧光由激光引起的荧光由激光引起的荧光 激光荧光激光荧光化学荧光在有生命的生物体中产生化学荧光在有生命的生物体中产生 生物发光生物发光u光致发光现象：光致发光现象：分子被紫外光或可见光照射而发光的现象分子被紫外光或可见光照射而发光的现象u根据激发态的类型和发光途径：荧光和磷光根据激发态的类型和发光途径：荧光和磷光u分子或原子吸收了特定波长的光，经过一很短的被称为激分子或原子吸收了特定波长的光，经过一很短的被称为

12、激发态寿命或荧光寿命的时间，然后发出波长较长的光的现发态寿命或荧光寿命的时间，然后发出波长较长的光的现象被称为荧光过程；磷光过程则具有较长的激发态寿命。象被称为荧光过程；磷光过程则具有较长的激发态寿命。3.3.荧光素荧光素( (荧光物质，荧光染料，荧光探针荧光物质，荧光染料，荧光探针) ) 能够产生荧光的化合物能够产生荧光的化合物 发射荧光的光量子数发射荧光的光量子数荧光效率荧光效率= = 吸收光的光量子数吸收光的光量子数反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率越大越好越大越好荧光素的荧光效率荧光素的荧光效率0.350.35斯托克斯位移（斯托克斯位移（stoke

13、s shiftstokes shift） 物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。 荧光素的发射波长总是大于其激发波长。荧光素的发射波长总是大于其激发波长。 两者的差值两者的差值 斯托克斯位移（斯托克斯位移（stokes shiftstokes shift）；）； 激发到发射过程中存在能量损失激发到发射过程中存在能量损失利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光 4. 4. 荧光素的性质荧光素的性质（1 1）激发光波长和发射光波长）激发光波长和发射光波长荧光素荧光素激发光波长激发光波长近紫外区域，

14、可见光区域近紫外区域，可见光区域发射光波长发射光波长可见光区域可见光区域发射光波长发射光波长 激发光波长激发光波长根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片荧光荧光激发光激发光( (excitation)excitation)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。称为该荧光素的激发光。激发激发/ /吸收光谱吸收光谱；吸收波峰吸收波峰( (最大最大吸收波长吸收波长) )发射光发射光( (emissionemission):): 用单波长的光照射荧光分子并记录发

15、射光的光谱可以用单波长的光照射荧光分子并记录发射光的光谱可以得到荧光分子的发射光谱得到荧光分子的发射光谱(emission spectrum)(emission spectrum)；发射波发射波峰峰( (最大发射波长最大发射波长) )（2 2）激发光谱和发射光谱）激发光谱和发射光谱荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质激发光谱激发光谱 荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱 荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化

16、的光谱用光谱扫描荧光分子并同时记录单个波长的发射光强度可用光谱扫描荧光分子并同时记录单个波长的发射光强度可以得到荧光分子的激发光谱以得到荧光分子的激发光谱(excitation spectrum)(excitation spectrum)；相似地用单波长的光照射荧光分子并记录发射光的光谱可相似地用单波长的光照射荧光分子并记录发射光的光谱可以得到荧光分子的发射光谱以得到荧光分子的发射光谱(emission spectrum)(emission spectrum)；激发光谱激发光谱发射光谱：发射光谱：镜像规则镜像规则 wavelength wavelength excitation spectru

17、memission spectrumex em 原因：原因：1.1.基态和激发态的振动能级间隔是很相似的。基态和激发态的振动能级间隔是很相似的。2.2.在许多情况，电子跃迁到激发态能级以后可以迅速在许多情况，电子跃迁到激发态能级以后可以迅速丢失能量而到达第一激发态的最低振动能级。发射时丢失能量而到达第一激发态的最低振动能级。发射时电子的跃迁多从第一激发态的最低振动能级开始的。电子的跃迁多从第一激发态的最低振动能级开始的。所以，发射光谱是电子从基态跃迁到第一激发态能级所以，发射光谱是电子从基态跃迁到第一激发态能级的吸收光谱的镜像，而不是整个吸收光谱的镜像。的吸收光谱的镜像，而不是整个吸收光谱的镜

18、像。3.3.电子回到基态的特定振动能级的几率同激发前电子电子回到基态的特定振动能级的几率同激发前电子所在能级的几率是相似的。所在能级的几率是相似的。激发光谱和发射光谱的用途激发光谱和发射光谱的用途激发光谱激发光谱确定荧光素适宜的激发波长的依据确定荧光素适宜的激发波长的依据发射光谱发射光谱确定荧光素检测波长的依据确定荧光素检测波长的依据最大激发波长最大激发波长ex 最大发射波长最大发射波长em 激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质 每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱（3 3）荧光强度）荧光强度荧光强度荧光强

19、度 荧光素发射荧光的光量子数荧光素发射荧光的光量子数决定荧光素检测的灵敏度决定荧光素检测的灵敏度荧光素的荧光效率决定其荧光强度荧光素的荧光效率决定其荧光强度（4 4）荧光寿命）荧光寿命荧光寿命（激发态寿命）荧光寿命（激发态寿命）电子在激发态的平均停留时间电子在激发态的平均停留时间荧光寿命长荧光寿命长 检测特异性和灵敏度高检测特异性和灵敏度高淬灭（淬灭（quenchquench）与漂白与漂白( (photobleachphotobleach) )： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 。n quench 淬灭是由同荧光发射竞争

20、的其它非发射过程造成的。非发射过程会淬灭是由同荧光发射竞争的其它非发射过程造成的。非发射过程会使减少荧光发射，有时可以完全消除发射。使减少荧光发射，有时可以完全消除发射。n reversible, non-radiative relaxation, collisional quench (oxygen, halogens, amines), static or complex quench (form non-fluorescent complex), n photobleach photobleach - -是由于光导致的共价修饰和化学破坏而使荧光分子永久失是由于光导致的共价修饰和化学破坏而

21、使荧光分子永久失去发出荧光能力造成的。去发出荧光能力造成的。n irreversible, destruction of fluorescence, irreversible covalent modification, photodynamic (light and oxygen, free radical oxygen), fluorescence recovery after photobleaching(frap)（5 5）荧光淬灭与漂白）荧光淬灭与漂白（6 6）自发荧光）自发荧光组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光 自发荧光自发荧光荧光探针

22、：荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（能产生荧光的特异性生物染料（pi, dapi)pi, dapi)、标有荧光标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）荧光染料的发展简史荧光染料的发展简史18381838年年 brewsterbrewster首次描述了荧光现象首次描述了荧光现象18521852年年 stokesstokes发现并描述荧光物质（荧光染料）发现并描述荧光物质（荧光染料）19031903年年 woodwood设计出可选择透过紫外光的滤光片设计出可选择透过紫外光的滤光片19111911年年 reicherlreicherl发明荧光显微镜发明荧光显微镜

23、19351935年年 haitinger haitinger 将荧光物质用于固定的细胞和将荧光物质用于固定的细胞和 组织，活细胞染色组织，活细胞染色新的荧光探针，新的检测技术不断出现新的荧光探针，新的检测技术不断出现荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究 激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜（laser scanning confocal microscope； ；lscm） ） 以以激光激光作为激发光源，采用光源针孔与检测作为激发光源，采用光源针孔与检测 针孔针孔共轭聚焦共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高技术，

24、对样本进行断层扫描，以获得高 分辨率光学切片的荧光显微镜系统。分辨率光学切片的荧光显微镜系统。什么是激光共聚焦扫描显微镜？共聚焦显微镜历史简介共聚焦显微镜历史简介n在传统的荧光显微镜中在传统的荧光显微镜中, , 来自汞灯或者氙灯的激来自汞灯或者氙灯的激 发光照射视野中的发光照射视野中的全部全部 样品样品，观察者可以用眼，观察者可以用眼 睛直接观察，也可以用睛直接观察，也可以用 ccdccd等设备直接拍摄荧等设备直接拍摄荧 光图像。光图像。n传统显微镜得到的图片传统显微镜得到的图片 容易受到轴向干扰和侧容易受到轴向干扰和侧 向干扰的影响而显得有向干扰的影响而显得有 些模糊。些模糊。传统显微镜的缺

25、憾传统显微镜的缺憾n对于有一定厚度的样品（大于对于有一定厚度的样品（大于2 2微米），一方面，微米），一方面， 由于在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激由于在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激 发，焦平面上的荧光图像将有一定的模糊，这被发，焦平面上的荧光图像将有一定的模糊，这被 称为轴向（称为轴向（z z）干扰；）干扰；n另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平 面上邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的面上邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的 对比度降低，这被称为侧向（对比度降低，这被称为侧向（xyxy）干扰。）干扰。焦点模糊焦点模糊zyx共

26、聚焦显微镜优势共聚焦显微镜优势n共聚焦显微镜很好的解决了传统荧光显微镜中焦面模糊的问题，解决了图像的轴向和侧向的干扰。n共聚焦显微镜同时还提供了光切能力，能对厚样品（例如花粉颗粒，果蝇大脑等）进行三维层切成像。19551955年，年，marvin minskymarvin minsky利用共焦原理搭建了一台共焦利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。19571957年，年，marvin minskymarvin minsky申请了共聚焦显微镜的专利。申请了共聚焦显微镜的专利。19701970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。

27、年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。19851985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像。以消除焦点模糊，得到清晰的图像。19871987年，年，bio-radbio-rad公司推出了第一台商业化的共聚焦显公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。微镜。共聚焦显微镜发展历史共聚焦显微镜发展历史u zeiss u olympusu nikon u leica u bio-radu meridian常见品牌的常见品牌的confocaln由于目前多数共聚焦显微镜所用光源为激由于目前多数共聚焦显微镜所用光源为激光，成像方式

28、为逐点扫描成像，因此又被光，成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为称为“laser scanning confocal laser scanning confocal microscopemicroscope”, ,“激光扫描共聚焦显微激光扫描共聚焦显微镜镜”。n激光共聚焦扫描显微镜发展至今，已经不激光共聚焦扫描显微镜发展至今，已经不再是普通的光学显微镜，而是光学显微镜再是普通的光学显微镜，而是光学显微镜与激光，高灵敏度探测器，高性能计算机与激光，高灵敏度探测器，高性能计算机和数字图像处理软件相结合的新型高精度和数字图像处理软件相结合的新型高精度显微成像系统。显微成像系统。共聚焦显微镜原理简介共

29、聚焦显微镜原理简介荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜荧光显微镜激发滤镜：激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 普通滤色镜普通滤色镜( (bp)bp)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：bp450-490bp450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合（lp lp + + kpkp）：）：lp450 + kp490lp450 + kp490 双色镜：双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：阻断滤镜：多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；lp490lp490紫外紫外蓝蓝绿绿高

30、高压压汞汞灯灯被荧光被荧光探针染探针染色的生色的生物样本物样本激发激发被标记被标记结构的结构的荧光光荧光光学图像学图像光学光学成像成像滤镜滤镜分光分光488nm 520nmfitc450nm 490nmmicroscopemicroscope荧光显微镜荧光显微镜confocal scan and detector confocal scan and detector unit unit 共聚焦扫描及检测装置共聚焦扫描及检测装置computercomputer计算机计算机laser and laser and electronicelectroniccontrol control unituni

31、t激光光源及激光光源及控制装置控制装置anti-vibration tableanti-vibration table防震台防震台共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置共聚焦装置共聚焦装置光源光源针孔针孔检测检测针孔针孔荧光显微镜荧光显微镜光电倍增管光电倍增管步进聚焦电机步进聚焦电机物镜物镜bio-rad lasersharp 系统操作，图像处理系统操作，图像处理3-d重建重建x/y扫描扫描装置装置光电倍增管光电倍增管检测针孔检测针孔光源针孔光源针孔光源光源分色镜分色镜物镜物镜样本样本聚集平面聚集平面共聚焦显微镜光学原理共聚焦显微镜光学原理 检测针孔和光源针孔始终聚焦

32、于同一检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔入检测针孔 高分辨率的光学切片高分辨率的光学切片 激光穿透性强激光穿透性强，可可对样本进行一定深对样本进行一定深度度光学光学断层，获得高标准的连续光学切片断层，获得高标准的连续光学切片 实现三维重建实现三维重建confocal microscopena point light source for illumination, a point light focus within the specimen, a pinhole at the image detecting pl

33、ane - these three points are optically conjugated together and aligned accurately to each other in the light path of image formation, this is confocal. nvoid of interference from lateral stray light: higher contrast. nvoid of supperimpose of out-of-focal-plane signal: less blur, sharper image. nimag

34、es derived from optically sectioned slices (depth discrimination) nimproved resolution (theoretically) due to better wave-optical performance. 共聚焦显微镜通过两点改进，使我们能够较清楚的观察共聚焦显微镜通过两点改进，使我们能够较清楚的观察厚生物标本的荧光：厚生物标本的荧光：首先是共聚焦显微镜的照明方式与荧光显微镜不同，首先是共聚焦显微镜的照明方式与荧光显微镜不同，共聚焦显微镜使用点照明技术：点光源被物镜聚焦到共聚焦显微镜使用点照明技术：点光源被物镜聚焦

35、到标本上，利用计算机控制的扫描器使光点在标本上逐标本上，利用计算机控制的扫描器使光点在标本上逐点扫描；这样在一个时间，标本上就只有一个点被点扫描；这样在一个时间，标本上就只有一个点被照亮，所以避免了大范围光照射时的侧面干扰。照亮，所以避免了大范围光照射时的侧面干扰。（lscm）激光光源特点：激光光源特点：1 单色性好，单色性好，2 方向性强，高亮度，方向性强，高亮度， 相干性好相干性好其次，在共聚焦显微镜的光检测器（光电倍增管，其次，在共聚焦显微镜的光检测器（光电倍增管，photomultiplier tubephotomultiplier tube，pmtpmt）前面设置有一个可以调）前面设

36、置有一个可以调节大小的针孔（称为共聚焦针孔）。这样，从聚焦平面节大小的针孔（称为共聚焦针孔）。这样，从聚焦平面的下部发出的荧光会聚焦在针孔的后面，被针孔板挡住的下部发出的荧光会聚焦在针孔的后面，被针孔板挡住；从聚焦平面的上部发出的荧光会聚焦在针孔的前部，；从聚焦平面的上部发出的荧光会聚焦在针孔的前部，所以也被挡住。只有从聚焦平面发出的光可以通过针孔所以也被挡住。只有从聚焦平面发出的光可以通过针孔达到光探测器。达到光探测器。confocal principle标本发出的荧光通过针孔后被光电倍增管检测到，最后标本发出的荧光通过针孔后被光电倍增管检测到，最后计算机利用光电倍增管的信息组成一幅图像。这

37、一过程，计算机利用光电倍增管的信息组成一幅图像。这一过程，模仿了使用切片机将某些不想观察的组织切掉的过程，只模仿了使用切片机将某些不想观察的组织切掉的过程，只是在这里使用的是聚焦的光，所以被称为光切片。是在这里使用的是聚焦的光，所以被称为光切片。共聚焦针孔的大小决定光切片的厚度。针孔越小，光切片共聚焦针孔的大小决定光切片的厚度。针孔越小，光切片越薄。但是厚度是不可能无限薄的。它还受到那些决定分越薄。但是厚度是不可能无限薄的。它还受到那些决定分辨率的因素的影响：如：光的波长、物镜的数值孔径、浸辨率的因素的影响：如：光的波长、物镜的数值孔径、浸没介质的折射率等。对一个物镜来说，其轴向的分辨率要没介

38、质的折射率等。对一个物镜来说，其轴向的分辨率要比侧向的差一倍。如果，使用一个数值孔径为比侧向的差一倍。如果，使用一个数值孔径为 1.4 1.4 的物镜的物镜，用波长为，用波长为 488 488 纳米的蓝色激发光来扫描标本，如果将纳米的蓝色激发光来扫描标本，如果将共聚焦针孔的开至一个共聚焦针孔的开至一个 airy disk airy disk 单位的大小，那么图像单位的大小，那么图像的侧向分辨率可达的侧向分辨率可达 200 200 纳米，可以得到的光切片的厚度是纳米，可以得到的光切片的厚度是 400 400 纳米。纳米。localization and co-localization三维胶原基三

39、维胶原基质培养的血质培养的血管平滑肌细管平滑肌细胞胞nreal-time observation 激光扫描共聚焦显微镜特点激光扫描共聚焦显微镜特点n图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理；种模拟的和数字的电子技术进行图象处理；n分辨率提高，使无损伤的光学切片成为可能，达到了分辨率提高，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；三维空间定位； n可以实时采集信号，为生命科学开拓了一条观察活细可以实时采集信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径；胞结构及特定分子、离子生

40、物学变化的新途径； n除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能。功能。1.虽然共聚焦显微镜能获取比普通显微镜更清晰的图片，但实际上共聚焦显微镜的分辨率只比普通光学显微镜有少量的提高，普通光学显微镜的分辨率理论极限大约是0.2微米，共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是0.15微米。2.共聚焦显微镜的一大限制是成像速度较慢，这限制了其用来研究生物领域中的一些快事件。共聚焦显微镜共聚焦显微镜的局限的局限1）xy分辨率：rxy=0.4波长/数值孔径，是传统显微镜rxy(0.61波长/数值孔径)的1.4倍，但比起透射电子显微镜0.1nm的分辨率仍低很

41、多，它是连接这两种常规技术的中间桥梁（11）。 2）待测样品最大厚度：约1-2mm. 3）样品最小光切厚度：40nm 4）z轴最大分辨率：0.35um. 5）扫描速度：slow：单向：220lines/s 512x512 2-3秒 双向：440lines/s medium：单向：450 lines/s 512x512 1.7秒 双向：900 lines/s fast：单向：1000 lines/s 512x512 0.7秒 双向：2000 lines/s 主要技术指标主要技术指标共聚焦激光扫描显微镜的应用共聚焦激光扫描显微镜的应用共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域

42、只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。扫描荧光显微镜观察。 形态学研究：形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的细胞凋亡、中枢神经系的f f联系、肿瘤细胞分类联系、肿瘤细胞分类 分子生物学：分子生物学：原位杂交，原位杂交，dnadna、rnarna定量，定量，dnadna损伤修复、损伤修复、外源外源性基因在真核细胞的表达、定位性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移荧光能量共振转移大分子构大分子构象的改变、受体与配体相互作用象的改变、受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量：活细胞动态荧光测量：细胞内细胞内caca+、

43、k k+ +、h h+ +等离子的动态分布等离子的动态分布及动态定量、及动态定量、荧光漂白恢复荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察：直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白的局限性：荧光漂白intensitybefore bleach after bleach 90 min after bleach1 1. . 荧光漂白恢复荧光漂白恢复 (fluorescence recover after (fluorescence recover after photobleaching; photoblea

44、ching; frapfrap) )检测细胞连接间的信息传递2 2. . 荧光能量共振转移荧光能量共振转移 ( (fluorescence resonance fluorescence resonance energy transfer)energy transfer)i.i.荧光能量共振转移荧光能量共振转移: : 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光供体荧光素素，能量的接受者叫，能量的接受者叫受体荧光素受体荧光素。供体荧光素供体荧

45、光素 受体荧光素受体荧光素1.1.供体与受体间的距离供体与受体间的距离 10 10nmnm或或= =1-7nm1-7nm2.2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠有实质性的重叠ii.ii.荧光能量共振转移的条件荧光能量共振转移的条件488nm 520nm 650nm540nm 650nm488nm 520nm供体荧光素供体荧光素 (cy2) 受体荧光素受体荧光素 (cy3)供体荧光素供体荧光素 (cy2) 受体荧光素受体荧光素 (cy3)fitc/tritc, cy3/cy5, bfp/gfpfluorescence fluorescence inten

46、sityintensitytime 检测检测 以供体的激发波长的光照射样品以供体的激发波长的光照射样品, ,没有没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。发出现荧光。应用应用 受体与配体的相互作用：亚基的受体与配体的相互作用：亚基的结合与分离结合与分离 大分子构象的改变大分子构象的改变ligandcy3cy5cy5iii. iii. 常用荧光共振转移探针对常用荧光共振转移探针对3. 3. 绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（gfpgfp） gfpgfp的发现的发现：6060年代，年代，shimomurashim