反义寡核苷酸抑制大鼠损伤视神经Nogo-A mRNA的表达

1、反义寡核苷酸抑制大鼠损伤视神经Nogo-A mRNA的表达 08-03-25 14:01:00 编辑：studa20 作者：袁容娣叶剑彭锡嘉刘少章【摘要】 目的：观察反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A的影响。方法：实验分为对照组、随机序列组、和2，5，10mol/L 3种Nogo-A反义寡核苷酸浓度组。大鼠视神经钳夹伤后，采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR），半定量分析反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A mRNA表达量的变化。 结果：反义寡核苷酸均显著降低Nogo-A mRNA的表达 （P 0.05)。结论：反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用。 【关键词】

2、 反义寡核苷酸Nogo-A视神经创伤RT-PCREffects of antisense oligodeoxynucleotides on Nogo-A mRNA expression in injured optic nerves AbstractAIM: To observe the effects of antisense oligodeoxynucleotides (ASODN) on Nogo-A mRNA expression in injured optic nerves. METHODS: A total of 30 rats were divided into five gr

3、oups: control group, random sequence group and test groups (2mol/L, 5mol/L and 10mol/L Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides). reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) method was used in the detection of the levels of Nogo-A mRNA in injured optic nerves. RESULTS: The result of RT-PC

4、R showed that Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides could significantly inhibit the expresson of Nogo-A mRNA (P0.01), random sequence antisense oligodeoxynucleotides had no noticeable effect on Nogo-A mRNA. CONCLUSION: Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides can inhibit the expresson of Nogo-A mRNA

5、in injured optic nerves. KEYWORDS: antisense oligodeoxynucleotides; Nogo-A; optic nerve; injury; reverse transcriptase-polymerase chain reaction0引言 视神经损伤是临床常见的眼外伤，迄今仍缺乏有效的治疗手段。研究证实，微环境中存在神经生长抑制因子是成年中枢神经再生能力低下的原因之一,中和或减少神经生长抑制因子可以促进成年哺乳动物RGCs轴突再生。Nogo-A是最具特征性的神经生长抑制因子。2000年美国、英国、瑞士的3个实验室1-3 同时报道Nogo基

6、因成功克隆，它编码3种蛋白（Nogo-A,-B,-C）。Nogo-A具有最强的神经生长抑制作用，其抗体IN-1可以中和这种抑制作用。研究表明4，反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞Nogo-A的表达具有抑制作用，我们通过在体实验研究反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A表达的影响。 1材料和方法 1.1材料 810wk Wistar雄性大鼠30只，体质量200250g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，分为实验组、随机序列组及对照组，每组6只，3个实验组分别用2，5，10mol/L 反义寡核苷酸10L球后注射，对照组用注射用水10L。硫代反义寡核苷酸序列为5-TGC TTT

7、 CGG TTG CTG AGG TA-3，浓度定为2mol/L；同时设计一段随机序列，其序列为5-GCA GAC CAG CGC GGA GCT-3。经基因库检索，Nogo-A反义核酸片段仅与Nogo-A有同源性，而随机序列同所有基因均无同源性。由大连Takara公司进行全硫代修饰（高纯度级）。1.2方法 10g/L戊巴比妥钠0.8mL(30mg/kg)ip麻醉， 暴露视神经，在球后2mm处用动脉夹夹持视神经40s，致伤后按以上分组分别球后注射不同浓度的反义寡核苷酸或注射用水，隔24h给药1次，共2次。伤后3d，断颈处死大鼠，取伤侧视神经置于组织研磨器中研磨匀浆，-70冻存备用。采用Triz

8、ol试剂提取视神经总RNA。用DU-640型紫外分光光度计进行定量。引物合成:特异性引物设计，采用Premier 5.0软件设计，并经NCBI BLAS向基因库检索验证，与其它基因无高度同源性。由TaKaRa生物公司合成。Nogo-A引物序列，引物1： 5-GTC CTG CTT GAA ACT GCT-3；引物2：5-CTT TCG GTT GCT GAG GTA-3。 以(-actin作为内参照，引物序列如下，引物 1： 5-ATC ATG TTT GAG ACC TTC A-3；引物2：5-CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3。RT-PCR反应：逆转录反应按照Promega

9、公司M-MLV逆转录酶说明书进行操作。取各实验组反转录产物2L，按以下条件进行扩增：（1）95C 变性样品5min；（2）94C变性30s；（3）50C 退火40s；（4）72C延伸60s；（5）返回反应（2），进行29个循环。最后一个循环72C延伸10min。PCR反应产物10L加载样缓冲液1L，以1TAE为电泳缓冲液，在20g/L 琼脂糖凝胶上电泳约1h(电压100V)。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶经LabWorks4.0凝胶用图像分析系统仪进行图像分析。由该系统分析Nogo-A及(-actin的积分光密度值（IOD）。以各组Nogo-A/-actin积分光密度的比值，作为Nogo-A的表达水

10、平。 统计学处理：应用单因素方差分析，比较各组Nogo-A表达的差异。采用SPSS10.0统计软件对计量资料进行统计分析（LSD-t 检验）。P 0.05时差异有统计学意义。 2结果 实验组（2，5，10mol/L）与对照组、随机序列组比较，Nogo-A mRNA表达差异显著（P 0.01，图1，2），提示不同剂量2mol/L反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达均有抑制作用。2mol/L组与5，10mol/L组比较相差非常显著（P 0.05）。随机序列组与对照组之间无显著差异 (P 0.05)。提示硫代随机序列对视神经损伤后Nogo-A mRNA的表达无明显影响。 图1 Nogo-A ASODN对视神经Nogo