优化农杆菌介导基因转化效率因子分析

1、 优化农杆菌介导基因转化效率因子分析刘彩萍 , 曾炳山 , 裘珍飞 , 李湘阳 , 刘 英 (中国林业科学研究院热带林业研究所繁育中心 , 广东广州 510520摘要 共培养法是农杆菌介导转基因比较常用的方法之一。 建立一个高效的遗传转化体系 , 除了确定抗生素种类 , 菌种和菌液浓度 , 预 培养和共培养时间等基本因子外 , 优化影响转化的因子非常重要。 主要介绍和分析共培养法中可能优化的影响基因转化因子 , 为提高 农杆菌介导转化率提供了方法和依据。 关键词 农杆菌 ; 预培养 ; 侵染液 ; 接种 ; 共培养 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010

2、03-01141-03Ana lysis of the O pti m i zed Factors on the Eff ic iency of A grobacterium M ted L IU Ca i 2p i n g et a l (B reeding Center of Trop ical Forestry I nstitute, Abstract Co 2culture is one of the Agrobacterium mediated . choice of antibi otics, Agrobacteri 2um strain and op tical density,

3、 ti m e of the p re 2co 2m transf or mation are als o very i m portant in develop ing an efficient genetic The op oduced in co 2culture method in order to p r ovide methods and basis for or mation . Key words ; I 2fluid; I noculation; Co 2culture基金项目 国家林业局 “ 948” 引进国际先进农业科学技术项目 (200624270 。作者简介 刘彩萍

4、(1980- , 女 , 山西宁武人 , 在读硕士 , 助理工程师 ,从事桉树转基因育种研究。收稿日期 2009209223 农杆菌 (Agrobacterium 是一种革兰阴性土壤杆菌 , 具有 天然的基因转移能力。 它可以侵染植物的受伤部位 , 将一段 编码激素合成酶的 DNA 片段转移到被侵染的植物细胞基因 组中 , 激素的过量生产导致被侵染的植物细胞自主生长 , 所 以被科学家改良作为植物转基因的工具。 用于植物基因转 移的农杆菌有两种类型 , 即含有 Ti 质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tum efaciens 和含有 R i 质粒的发根农杆菌 (Agrobacter

5、ium rhizogenes 。 在目前的应用中 , 主要以根癌农杆菌介导法为主1-2。 与其他转基因方法相比 , 农杆菌介导法具有转化率高、 导入植物细胞的片段确切 , 且导入的片段 拷贝数低、 表达效果好 , 使用的技术和仪器简单 , 是转基因方 法中最普及、 经济和有效的方法 1。 利用农杆菌介导进行林木基因转化的方法有叶圆片法、 共培养法和直接接种法 , 其中共培养法利用比较普遍3。建立一个遗传转化体系 , 在确定了基本的技术参数指标 后 , 需要逐步优化影响因子 , 从而提高转化效率。 用农杆菌 介导的共培养法来建立遗传转化体系时 , 一些基本的因子包 括抗生素的确定、 菌种的选择、

6、 菌液浓度、 预培养时间、 泡菌 时间和共培养时间等 , 通过优化其中的一些影响因素 , 可以 有效提高转化率 , 起到事半功倍的效果。 笔者主要介绍和分 析共培养法中可能优化的基因转化因子 , 为提高农杆菌介导 转化率提供方法和依据。1 预培养培养基的优化外植体进行共培养前 , 一般都要在含有外源激素的培养 基上预培养一段时间 , 目的是使植物组织代谢活跃 , 促进细 胞分裂 , 分裂状态的细胞更易整合外源 DNA, 从而提高外源 基因的瞬时表达和转化率4-5。 预培养的培养基一般是固定的 , 即为适合外植体再生的培养基 , 但是也有人认为 , 在预 培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。

7、钙在对致病微 生物抵抗方面起到重要作用 , 而钙的不足会引起细胞壁结构的改变 , 这种改变使农杆菌更容易附在愈伤上 , 增强农杆菌 对愈伤的感染能力。 苏文潘等6在农杆菌介导橡树遗传研究中发现 , 外源钙的修饰改变了橡胶树胚胎组织结构 , 随着 外源钙的增加 , 多糖化合物增多 , 刺激了细胞的分离。 Mon 2t or o 等7发现 , 橡胶树愈伤组织在无 CaCl 2培养基上预培养一段时间后 , 可以提高报告基因的瞬时表达活性 , 从而提高 转化效率。 Mont or o 等 8在进行外源钙对农杆菌介导的橡胶 树转基因影响的试验中发现 , 在无 CaCl 2培养基上继代培养2个星期的愈伤组

8、织 , 内源钙降低了 91%, 细胞接受外源基因的活性增加。 另外 , 培养基中其他成分如激素、 有机营养 物质等 , 都能使细胞处于活化状态 , 更容易接受外源基因。 例如 ,NAA 与 62BA 的使用可以明显提高水稻的转化效率 , 而 ABA 则明显降低转化率9。2 侵染液制备方法的优化侵染液的制备是农杆菌转化的关键之一 , 侵染液中农杆 菌的活力直接关系到共培养中农杆菌的侵染能力。 农杆菌 液体培养方法通常有两种 :一种是先通过小管培养 , 得到一 定体积的农杆菌菌液后 , 转入三角瓶中继续培养到一定的光 密度 OD 值 ; 另一种是培养到一定浓度后 , 用固定体积的液 体培养基稀释一

9、定的倍数到需要的光密度 OD 值。 王文燕 等10在根癌农杆菌介导 Lesquerella fendleri L. 转化的研究中认为 , 农杆菌培养至一定的 OD 600值比重新悬浮至一定的OD 600值转化率高。 原因可能是直接培养的农杆菌的活性比稀释重新悬浮后的农杆菌活性高 , 因此感染能力强。为了提高农杆菌的侵染能力 , 通常会在侵染液中添加一 些辅助物质。 AS 是最多用于诱导 vir 基因转录活化的酚类 物质 , 已证实 AS 对多种植物的农杆菌诱导有效 , 并且 AS 的 促进效果与菌株类型、 植物材料种类和共培养培养基的 pH 值有关。 AS 的添加方法有 3种 :共培养培养基中

10、添加、 侵染 液中添加及在侵染液和共培养培养基中同时添加 , 其效果视 不同植物而异 , 而且同种外植体对于不同添加方式的效果也 不同。 范春节11用尾赤桉叶片和茎段作为外植体 , 分别在共培养培养基、 农杆菌悬浮液 , 以及同时在二者中都添加 , 试验结果表明 , 以茎段为外植体时 , 在菌液中添加 100mol/L安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri . Sci . 2010, 38(3 :1141-1143, 1202责任编辑 熊章琴 责任校对 卢瑶AS, 转化率约为 50%, 而在共培养培养基中添加 AS 会抑制 农杆菌的转化效率 ; 以叶片为外植体时 , 无论

11、是在共培养培 养基中单独添加还是在菌液中单独添加都能提高转化效率 , 但同时添加反而效果不明显。 在共培养培养基中添加 100mol/LAS, 转化率为 46. 7%, 而对照为 20%。 张晓英等 12对国槐遗传转化体系的优化试验表明 , 国槐叶片在侵染前的 菌液和共培养培养基中分别添加 200mol/LAS 能够提高 转化频率 5. 35、 3. 32倍。 也有研究者认为乙酰丁香酮在低 pH 值条件下的效果更好。 郝贵霞等 13对毛白杨遗传转化 研究表明 , 只有将 pH 值调至 4. 85. 0, 加入 200mol/LAS 时 , 才能大大提高转化率。 杨秀荣等 14研究了乙酰丁香酮

12、对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响 , , 在培养基 pH 值为 5. 8时加入 AS,为 4. 0%12. 5%,至 5. 2后 , 加入 特别是 AS 的浓度为 25, 卡那霉素抗性芽获得率提高到 35. 7%。植物受伤后除了大量释放酚类物质 , 还会释放糖类等小 分子 , 这些小分子一方面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运 动 , 另一方面可诱导或抑制农杆菌 vir 基因的表达。 酚类化 合物的作用是吸引农杆菌的趋化运动 , 与农杆菌染色体基因 编码的 P10、 P21蛋白结合 , 激活 vir A 蛋白进而诱导农杆菌 vir 基因的表达。 而糖类的主要作用是与农杆菌染色体毒性 蛋白 Ch

13、vE 结合 , 激活 vir A 蛋白进而诱导 vir 基因高水平表达 和扩大农杆菌的寄主范围。 特别在 AS 浓度很低的情况下 , 它们可强烈诱导 vir 基因的表达 , 并且与 AS 存在协同效应 , 可显著提高 AS 诱导效果。 刘斌等 15在反义磷脂酶 D 基因 转化毛白杨的研究中 , 对传统的侵染液制备方法进行了改 良 , 将已经培养好的农杆菌菌液用 13倍的 5%蔗糖附加一 定浓度的表面活性剂稀释菌液制成侵染液 , 将切好的叶片置 于侵染液中侵染 , 得到的再生芽经 PCR 检测为转基因芽。 这种侵染液的制备方法既增加了侵染液中蔗糖的浓度 , 又减 去了离心操作步骤 , 并且达到了

14、在浸染液中附加一定量的乙 酰丁香酮同样的作用 , 其结果比只用液体培养基稀释更好 些。 H iei 等 16认为较低的 pH 值、 低于 28 的温度、 较高的 渗透压、 适当浓度的冠瘿碱及一些糖类等都能有效地增强基 因的表达。 糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显 , 但 是糖类和酚类化合物同时存在时却没有明显的协同效应。 多胺 (Polya m ines, P A s 腐胺、 亚精胺等 是一种生物体中 广泛存在的代谢产物 , 是具有调控作用的低分子量脂肪族含 氮碱 17-18。 多胺也参与植物宿主和病原之间的相互作用。 Ku mar 等 19曾用多胺物质对农杆菌进行活化后侵染烟草做 G

15、US 瞬时表达研究 , 结果表明农杆菌的侵染活力显著提高。 祖勇 20利用多胺对携带植物表达载体 pB I 121的农杆菌 EHA105进行活化之后侵染欧美杨 107的叶环。 G US 瞬时表 达分析表明多胺活化使农杆菌的侵染效率增强 , 腐胺和亚精 胺处理分别为对照的 2. 4、 1. 8倍。 经腐胺处理的 EHA105侵 染欧美杨 107叶环所获得的 G US 瞬时表达效果优于亚精胺。 3 接种方式的优化比较常用的接种方式是将外植体置于侵染液中浸泡 , 时 间长短视菌种和外植体种类而异。 有的研究者在浸泡的基 础上结合了振荡进行接种 , 得到了转基因植物。席梦利 等 21在研究不同因素对农

16、杆菌介导的杉木转化效率影响的 试验中 , 将茎段外植体进行振荡接种 , 经过 PCR 检测得到了 抗性芽。 振荡培养的优势在于通过振荡打破细胞表面的气 泡 , 使农杆菌与外植体的接触面增大 , 有利于农杆菌侵染。 近年来 , 在提高遗传转化效率方面发展了一些新技术 , 如超 声 波 辅 助 农 杆 菌 介 导 法 (S AAT:s onicati onassisted Agrobacterium mediated transf or mati on 负压与农杆菌介导结 , 均可增强农杆菌浸 染 , ,22S AAT 法将外源基因转入大豆中 , 其转化效率显著高于单纯的农杆菌介导法。 姜玲等 2

17、3以番木瓜品种 Sunset 的胚性愈伤组织为试验材料 , 用超声波 处理 15s 后得到 26. 3%的转化率。 S AAT 法在林木遗传转 化方面也取得了一定的进展。 Santar m 等 24在将 gus 基因 和 hpt 基因转化棕榈的研究中发现 , 采用 S AAT 法的转化效 率比采用农杆菌介导法提高 30%45%。 可能由于超声波 处理可在受体材料表皮和深层造成许多微损伤 , 有利于农杆 菌进入组织内部 , 同时从伤口处分泌出较多的酚类物质 , 有 助于提高农杆菌的转化活力 , 明显地提高农杆菌的感染效 率。 另外 , Zarag oza 等 25将抗除草剂基因 bar 通过 S

18、 AAT 转 入刺槐 , 获得转基因植株。负压处理会在转化材料上形成许多细小的伤口 , 导致组 织液大量外流 , 流伤液中的酚类物质可刺激农杆菌的活力 , 同时大量细小伤口的形成可提高农杆菌侵染的机会 26。 毕 瑞明 27以六倍体普通小麦 HB341、 S N2618、 TS021和四倍体 栽培二粒小麦成熟种子为试材 , 采用整粒切胚诱愈的方法 , 通过农杆菌 G V3101pB I 121:gus 介导 , 研究负压处理对小麦 成熟胚遗传转化的影响。 结果表明 , 负压处理对小麦成熟胚 愈伤组织的诱导没有显著影响 , 但对小麦成熟胚的遗传转化 却有显著性影响。 负压处理能够提高小麦成熟胚转

19、化效率 , 分别较对照组提高了 9. 37、 10. 90和 10. 03倍。 但是负压处 理造成的伤口也会对植物细胞造成一定的伤害 , 使用 T ween 处理能够对细胞起到一定的保护作用 , 可降低细胞伤害 , 在 提高转化率的同时提高存活率 22。 刘志学等 28以水稻愈伤 组织为受体材料 , 在与菌液混合时辅以 T ween20和负压处 理 , 用 gus 报告基因的瞬间表达作为指标 , 与仅用 T ween20或 仅用负压处理的样本进行了比较研究。 试验结果表明 , 适当 的负压处理可提高转化频率 , 而过度的负压处理会对材料造 成较大的伤害 , 从而降低其成活率 , 如同时使用 T

20、 ween20可 以减轻这种伤害。此外 , 有人基于农杆菌转化机理结合基因枪法创建了 “ 农杆枪法 ” (Agrolistic , 将 V ir D1、 V ir D2基因连 T 2DNA 上的 目的基因一同用基因枪打入植物细胞中 , 表达的 V ir D1、 V ir D2能在植物细胞内切割保守序列并一起转入细胞核。 该 方法集中了农杆菌转化方法中精确切割转移和低拷贝整合 等特性以及基因枪法中无宿主范围限制的优点 , 因而是一种 有发展前途的新思路。2411 安徽农业科学 2010年 4 共培养中除菌方式优化及激素添加问题共培养是整个转化过程中非常重要的环节 , 因为农杆菌 附着、 T 2D

21、NA 的转移及整合都在这一时期内完成。 共培养时 的有 3个关键技术 :共培养的时间、 农杆菌的增殖适度和共 培养中激素的影响。 共培养的时间主要采用 G US 染色来确 定 , 表达率高、 染色面积大为优。 农杆菌的增殖适度直接与 转化有关 , 如果农杆菌增殖生长不良 , 只有很少的农杆菌生 长 , 则转化的几率很小 , 反之 , 农杆菌在外植体四周过度生 长 , 可能引起外植体毒害 , 褐化死亡 1。 刘斌等 15将农杆菌 侵染后的叶片不经冲洗而直接转到预先用浓度 5%蔗糖液浸 湿的滤纸上过夜 , 既延长了农杆菌浸染时间又不致因叶片在 菌液中浸泡时间过长而坏死 ,试验证明 , ,杆菌 ,

22、29。 另外 , Jassen 等 30, 加滤纸 显著优于不加滤纸 , 前者的 G US 短暂表达率为 10%34%, 后者仅为 2%16%。 而冯勤等 31也认为农杆菌与外植体 共培养时 , 固体培养基表面加 12层灭菌滤纸有利于控制 外植体上的农杆菌过度繁殖 , 防止外植体褐化坏死。 易自力 等 32在洗菌之后 , 将水稻愈伤组织置无菌滤纸上干燥培养 , 以除去组织中多余的水分。 结果表明 , 通过这种干燥处理 后 , 既能有效提高愈伤组织的存活率和分化率 , 又能有效抑 制农杆菌的生长。共培养时培养基中是否加激素目前还没有定论 , 大多数 人采用添加激素的方法。 程家胜 33认为共培养

23、的培养基中 附加一定量的植物激素是非常必要的。 刘庆忠等 34报道培 养基中附加生长素极大地提高转化率。 而 De Bondt 等 35则 认为培养基中含有高浓度细胞分裂素比含高浓度的生长素 对基因转移更有利 , 外植体在感染农杆菌后或由于抗生素的 加入 , 细胞的生长受到影响 , 往往要调整培养基的成分促进 外植体的再生。 共培养时的光照视植物种类而异 , 有些植物 需要光培养 , 有些需要暗培养。 有研究显示连续光照能显著 提高农杆菌转化植株的效率 , 但是具体机制还不清楚 , 可能 是光照提高了寄主细胞对 T 2DNA 复合物的接纳能力 36。 5 褐变问题的优化处理在选择培养的后期 ,

24、 外植体褐变是比较常见的问题 , 同 时也是诱导脱分化及再生芽的重大障碍。 褐变主要与外植 体受损、 培养基水势及外植体转移时间有关。 张妙霞等 37在研究柿树的玻璃化现象中报道 , 培养基中琼脂粉含量由 6 g/L提高到 10g/L后 , 培养基的水势降低了 0. 030. 04 MPa, 试管苗的水势降低了 0. 09MPa, 减轻了褐变。 在其他 植物上 , 也有许多报道认为 , 保持温和的渗透胁迫 , 对植株再 生有很大的影响 , 可能是因为高浓度的琼脂对愈伤组织产生 了一种水分或营养胁迫 , 或者引起愈伤组织透气性的增加 , 从而减少愈伤组织的褐变 38。农杆菌介导的植物遗传转化是一

25、个复杂的生物过程 , 受 多种因子共同作用。 一些常规的基本转化因子确定后 , 并不 能保证建立的农杆菌介导转基因体系是高效的 , 所以对遗传 转化的主要因素进行优化是十分必要的。 优化的过程就是 寻找各个作用因素的最佳组合 , 使之都高效地发挥作用。 这 样不仅可以提高农杆菌转化能力 , 而且会节省时间和材料 , 起到事半功倍的效果。参考文献1王关林 , 方宏筠 . 植物基因工程 M.2版 . 北京 :科学出版社 , 2002. 2韦大器 . 林木抗病基因工程进展 J .亚热带植物科学 , 2005, 34(3 :74 -77.3肖尊安 . 植物生物技术 M.北京 :化学工业出版社 , 20

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36、 , 随着水分胁迫程度的加深 , 桃树叶片可溶性蛋白含量 降低 , 游离氨基酸含量增加 , 硝酸还原酶 (NR 、 谷氨酸合酶 (G OG AT 、 谷氨酰胺合成酶 (GS 活性降低 , 谷氨酸脱氢酶 (G DH 活性先升高后降低。硝酸还原酶 (NR 是植物氮代谢中一个重要的调节酶 和限速酶 13。 NR 对水分胁迫非常敏感 14。 该试验结果表 明 , 随着水分胁迫时间的延长桃树叶片 NR 活性逐渐降低 , 且 NR 活性下降幅度表现为 :处理 处理 。 植物氮素吸收 主要依靠 GS/GOG AT 循环。 目前 , 谷氨酰胺合成酶 (GS 与 谷氨酸合酶 (G OG AT 构成的循环被认为是

37、高等植物氨同化 的主要途径 15。 水分胁迫下 GS片 NH4+2N 积累 , 该试验中桃树叶片 GS G AT 均低于 CK, :G OG AT NR , 使得 NO 3 -还原、 NH4+, NH4+及中间产物2酮 戊二酸供应不足所致。 谷氨酸脱氢酶 (G DH 是一类广 泛存在于植物、 动物、 微生物中的氧化还原酶 , 其催化的主要 反应 是 :谷 氨 酸 +NADP 2酮 戊 二 酸 +NADPH + NH 4+。 研究表明 , 植物在水分胁迫、 盐渍、 污染及病原菌侵 染条件下均会引起 G DH 活性变化 11。 该研究结果表明 , 由 于 GS/GOG AT 途径的限制 , 使得在

38、水分处理前期桃树叶片 G DH 酶活性提高 , 其原因可能是处理前期 GS 活性降低 , 使 NH 4+离子同化受阻 ,NH 4+发生积聚所致 16。 但随着处理时 间的延长 , G DH 活性呈下降趋势。目前 , 有关逆境影响植物氮代谢过程中关键酶活性的研 究结果尚存在较大差异 , 但根据现有研究结果可知 , 逆境条 件不仅对植物体内氮代谢关键酶的活性产生影响 , 而且可引 起植物氮代谢途径的改变 , 这可能与植物对逆境的适应性调 节有关。 参考文献1孙洪强 , 庞占荣 , 蒋春光 . 水分胁迫对果树形态和生理生化指标的影响 J.北方果树 , 2008(1 :1-3.2BRADF ORD M

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