人体外周血淋巴细胞培养基的质量体系标准化及其应用

1、中南大学硕士学位论文人体外周血淋巴细胞培养基的质量体系标准化及其应用姓名李浩申请学位级别硕士专业遗传学指导教师邬玲仟20070601硕士学位论文摘要目的人体外周血淋巴细胞培养基作为一种专用于染色体病检查的体外诊断试剂技术成熟应用广泛。但目前我国尚没有此类产品的质量标准和相应规范。本课题旨在建立一套符合国家相关标准、行之有效的质量体系提高人体外周血淋巴细胞培养基的产品品质使其满足国家食品药品监督管理局颁布的医疗器械注册管理办法的要求以达到取得医疗器械产品注册证的目的。方法深入学习夏家辉院士数十年来的研究成果特别是用于染色体诊断的培养基技术同时参照全球通行的质量体系在国家相关法规的指导下针对人体外

2、周血淋巴细胞培养基的各个质量控制环节进行标准化规范。以产业化基地湖南湘雅基因技术有限公司为应用平台完善人体外周血淋巴细胞培养基的质量控制申请医疗器械生产企业许可认证申报人体外周血淋巴细胞培养基的医疗器械产品注册。结果、对人体外周血淋巴细胞培养基的质量体系进行了标准化规范。、湖南湘雅基因技术有限公司通过医疗器械生产企业许可认证。、人体外周血淋巴细胞培养基获得医疗器械产品注册证。结论该课题建立的质量体系能显著加强产品质量控制指导并完善生物科技企业的质量管理活动该质量体系的应用促进了科研成果向生物技术产品的迅速转化推动了国内染色体诊断试剂市场的发展。关键词质量体系培养基医疗器械注册硕士学位论文糟、儿

3、硕士学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知除了论文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说明。作者签名专谔日期圭竺年月尘日关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学宦畚牡墓娑囱腥粞宦畚脑市硌宦畚谋徊樵暮徒柙难？梢怨佳宦畚牡娜炕虿糠帜谌菘梢圆捎酶从跤蚱渌侄伪嫜宦畚难？筛莨一蚝鲜泄夭棵殴娑徒谎宦畚摹排蜃髡咔筢赖际鋈掌谯跄晟显氯铡笛橐瞧魇笛橐瞧骷八檬约恋绫浜纠涔窈九嘌涔酒胀

4、阄屡嘌涮旖蛱固匾黄鸸竞阄滤涔靖咚倮胄幕境魈罩菥换坦狙垢腔心现埔党稍锵涮旖蛱固匾黄鸸镜缱犹炱教锕境克枪舅肯晕蛋铝职退构救旧宸治龉髡纠晨镜缍埔浩鞴菊婵毡霉疽埔浩鞴炯乒炯獬景蛹剖鹘账站患庞邢薰炯扑慊鞫尽笛槭约良昂牟摹尽尽竟芄竟芄疽淮涡岳胄墓芄疽淮涡岳胄墓芄菊胧焦似鞴久鹁鸾杭觳槭痔坠鹆秩榻撼淮涡允痔咨虾嫉吕芰现破烦姿岷匣约磷艹兹芤汉鲜洞笱约脸匏掖己鲜洞笱约脸脊呕约凉厩庋趸扑罩萏以葱峦竟靖嗡啬谱湟航胀虬钌搅乒煞萦邢薰韭然乒玖姿崆舛乒韭然毓靖呙趟峒爻撤致房谒芰匣状忌虾蕉蓟约脸蘧淦鹘鹘跏搅破餍涤邢薰九嘌抗九嘌抗竟似鞴竟似鞴拘陆喽鸪秤昊疽邢薰厩嗝顾毓胖埔艹疵顾鼗敝埔煞萦邢薰炯啡蜓羰惺约寥颂逋庵苎馨拖赴嘌返闹柿

5、刻逑标准化及其应用刖吾质量管理是在质量方面指挥和控制组织的协调活动通常包括制定质量方针、目标以及质量策划、质量控制、质量保证和质量改进等活动。实现质量管理的方针目标有效地开展各项质量管理活动必须建立相应的管理体系这个体系就叫质量管理体系它可以有效达到质量改进。是目前国际上通用的质量管理体系【】。是英文的简称即国际标准化组织。它是一个国际性的非赢利的组织目前的成员已经超过了个我国也是其成员之一就是在世界范围内推行最成功地标准之一。这套标准是由国际标准化组织的下属委员会一质量管理和质量保证技术委员会代号为负责起草的。年发布的版族标准也就是我们现在各个媒体上经常听到的、标准的基础。这套标准在推出以后

6、得到了世界上的普遍关注越来越多的企业将其作为质量管理的标准之一的系列认证已经成为国际问商贸交流和市场的通行证之一其中的认证较为适合体外诊断试剂的应用标准我国于年月日发布版的中文版即国标。医疗器械注册是指依照法定程序对拟上市销售、使用的医疗器械的安全性、有效性进行系统评价以决定是否同意其销售、使用的过程在中华人民共和国境内销售、使用的医疗器械均应当按照医疗器械注册管理办法的规定申请注册未获准注册的医疗器械不得销售、使用【】我国自年月日正式施行医疗器械注册管理办法并于年月日经修改后推出新版本年月日起国家食品药品监督管理局颁布实施体外诊断试剂注册管理办法试行进一步指导了包括培养基在内的体外诊断试剂的

7、注册管理工作。染色体检查是确诊染色体病的主要方法【】人体外周血淋巴细胞培养基作为人类医学遗传学、生殖医学领域中一种有效的染色体分析试剂材料在遗传诊断和产前诊断中起着重要的作用。由于各方面的原因在我国还没有此类产品的质量标准和相应规范。国内各医院和实验室进行染色体检查所用的培养基没有统一标准质量极不稳定常导致无法进行染色体分析影响疾病的诊断。中国工程院院士、著名人类与遗传学家夏家辉教授年恢复医学遗传学研究工作以后在参考国外研究文献的基础上自行研制人体外周血淋巴细胞培养基并用于临床染色体检查分析年正式将此方法向全国推广应用。年中国医学遗传学国家重点实验室以此培养基专有技术作为技术入股的一部分参股湖

8、南湘雅基因技术有限公司。本课题的主要工作分为两部分一部分是建立一套较为合理高效的质量体系根据国家的相关法规条例进行标准化用于指导人体外周血淋巴细胞培养基的质量控制另一部分是应用该质量体系申请类医疗器械生产企业许可证和医疗器械注册证以带动其它相关产品的产业化进程。第一章人体外周血淋巴细胞培养基的质量体系标准化质量体系的技术基础要将人体外周血淋巴细胞培养基的质量体系进行标准化首先要深入学习研究其技术基础才能针对重点进行规范。人体外周血淋巴细胞培养基由超纯水、一种富含无机盐、氨基酸、维生素等营养成分的培养基、血清、抗菌素、淋巴细胞刺激因子组成。当人体外周血被种入该培养基后在适宜的条件下能转化外周血中

9、的淋巴细胞使其分裂、增殖当细胞增殖达到一定数量的时候加入秋水仙素使细胞停止于分裂中期再经过低渗固定显带染色等处理在显微镜下进行染色体分析以确定外周血提供者是否存在染色体异常。人体外周血淋巴细胞培养技术体系包括了培养基的生产和质量检验两部分。通过多道严格控制的工艺配制出来的培养基必须经过质量检验的审核把关合格后方可用于外周血淋巴细胞的培养。人体外周血淋巴细胞培养基的生产人体外周血淋巴细胞培养基的生产是一个连续性的过程。整个工艺流程中包括了玻璃器皿的清洗与消毒、橡胶类制品的清洗与消毒、的配制和培养基的配制与分装等多个步骤每一个环节都是培养基质量的影响因素同。玻璃器皿清洗与消毒。在细胞培养中清洗工作

10、是一个十分重要的工作因为离体细胞对任何有害物质都十分敏感。有害物质包括微生物细胞残余物以及非营养成分的化学物质都可影响细胞的生长残留在培养用品中的百万分之一的洗涤剂成分都足以妨碍细胞的生长灭菌操作更是直接关系培养成功的关键程序。细胞培养基的生产过程中清洗后的玻璃器皿要求干净透明无油迹。且不能残留任何有毒物质一般玻璃器皿的清洗包括刷洗、浸酸和冲洗三个步骤灭菌程序则采用干热灭菌方式用刷子刷洗干净自来水冲洗次倒置沥干完全浸没于硫酸与重铬酸钾洗涤液中至少时从洗涤液中取出自来水冲洗次一纛水冲洗次二蒸水冲洗一次烤干干热灭菌后使用橡胶类用品清洗与消毒橡胶类用品可能存在干结的附着物尤其是新购置的橡胶塞常有大量

11、滑石粉应先用自来水冲洗干净后再作常规处理。适量碱性洗涤剂溶液浸泡煮沸分钟反复搓洗次自来水冲洗次自来水煮沸次用盐酸浸泡至少小时自来水冲洗次每次冲洗分钟并反复用手搓洗上自来水煮沸次冲洗次上一蒸水煮沸次二蒸水煮次高压蒸汽灭菌各用的配制作为外周血淋巴细胞培养的基础培养基直接关系到细胞的生长状态。它的准确配制是人体外周血淋巴细胞培养基合格的基础准确称取上将用于配制培养基的粉剂倒入烧杯中亟堂焦监毫厶佳筮尉堂盎巴翔腿接羞基殴厦重焦丞拯蕉丝上加入超纯水用玻璃棒搅拌溶解将的倒入烧杯中并充分搅拌溶解逐滴加入的在计检测下滴定至至的值倒入定容瓶中定容至过滤器抽滤除菌分装成瓶密闭僳存人体外周血淋巴细胞培养基的配制与分装

12、该工艺程序中最需要重视的就是无菌操作其配制分装的准确性也十分重要成分和剂量都应准确否则将影响培养基的质量。吸玛的新生小牛血清和的淋巴细胞分裂刺激因子至的基础培养基充分混匀用的无菌吸管吸取混匀后的培养基分装至灭菌小圆瓶中每瓶分装分装完毕后迅速用醇灭菌的止血钳盖上灭菌小橡胶塞上将小圆瓶盖上铝盖用压盖机压紧人体外周血淋巴细胞培养基的质量检验每批人体外周血淋巴细胞培养基产品生产后都必须进行质量检验以确定其是否合格。分裂指数的检验目的在于检查培养基是否能够促进细胞的分裂增殖以获得足够的中期染色体分裂相用于染色体检查等工作无菌检验的目的在于培养基在恒温培养的状态下是否能保证无菌避免出现由于培养基污染导致试

13、验工作失败的情况分裂指数检验采血用肝素湿润无菌注射器抽取外周血。种血在无菌条件下用号针头垂直种血士抗凝血至人体外周血淋巴细胞培养基内。培养置恒温箱中培养小时每小时轻轻摇晃一次培养瓶使细胞获得充分营养。细胞学处理在培养完成前小时加入浓度为的秋水仙素滴号针头竖滴后继续培养小时。将培养液用吸管吸至离心管中离心管离心分钟。弃上清固定液加入已预温至的氯化钾溶液约用吸管充分打匀放入水浴箱中温育分钟。在离心管中加入新鲜配制的预温至的甲醇、冰醋酸固定液左右轻轻混匀。离心分钟。弃上清固定液加入新固定液约轻轻混匀离心分钟。弃上清固定液加入新固定液约轻轻混匀离心分钟。弃上清固定液加入左右的新固定液制成细胞悬液将细胞

14、悬液滴于用冰水预冷的载玻片上一般高度为左右每张载玻片上滴滴。立即放入烤箱中烤片小时。染色体显带将经烤片处理的玻片放入预温至的溶液中染色分钟自来水冲洗干净晾干后即可阅片。计数分裂指数将玻片在倍油镜下计数个细胞将数得的中期分裂相数除以得到的结果即为此批培养基的分裂指数。分裂指数大于等于方为合格。无菌检验将样品置连续培养天后取出观察未见浑浊外观仍清亮即为合格见图。图经无茸检验的外用血淋巴细胞培养基产品为无菌检验合格产品培养基呈粉红色澄清透亮为无茵检验不合格产品培养基呈黄褐色浑浊有沉淀。质量体系的建立生产环节控制培养基生产是连续性、流程性生产过程见图无法进行半成品的返工因此对生产过程的控制尤为重要。为

15、确保培养基产品的整个生产过程始终处于受控状态加强管理达到提高效率、降低成本、生产符合产品质量标准和用户要求产品的目的就必须编制产品工艺流程、工艺规定、操作规程等技术文件【】并认真依照管理制度和技术标准、有关操作规程及作业指导书对生产过程进行组织实施和控制保证工艺的合理设置和正确执行【】。目卜生产工艺漉程图及关健控制点说明目图中带符号的工艺程序即为关键控制点原材料质量控制根据人体外周血淋巴细胞培养基的生产需要。制定完善了原材料管理办法以保证达到生产所需原材料的质量要求从国内外选择合格的原材料厂家建立稳定的原材料供应渠道。采购部门根据生产部门提供的湖南湘雅基因技术有限公司原材料申购单综合实际原材料库存情况和到货周期及时采购原材料。耍堂焦丝室厶焦处厘垒燮垦玺毽接菱基鳇廑量签丞拯垄丝由质检部对原材料进行抽样检查包括出厂合格证明生产日期成份以及试剂检测情况等不合格的产品应立即退还厂家并进行索赔。根据原材料的存储要求分类存放同时将原材料的数量、金额、供应厂家、存放位置、有效期等相关信息录入数据库实行数据库管理。生产环境质量控制根据人体外周血淋巴细胞培养基的生产需要制定完善了生产车间环境质量控制规定确保达到环境控制的要求。分装室内不得超过人。减少各室内人员流动随手关门严格遵守无菌操作原则工作人员应保持良好的个人卫生勤洗澡勤换衣勤理发不得留指甲和涂指甲油。进车间前先开风