选择性产生雄性或雌性不育植物的方法(专利)

1、选择性产生雄性或雌性不育植物的方法CN 1639344 A摘要本发明公开了一种生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：用多核苷酸转化植物材料，该多核苷酸编码至少一种与非毒害植物的物质反应产生毒害植物物质的酶，再生这种转化的材料为植物，其中不超过雄性或雌性配子形成和/或成熟的时期，向所述植物施用所述非毒害植物的物质，由此，非毒害植物的物质提供了毒害植物的物质的产生，该毒害植物的物质选择性阻止了所述配子的形成或使其没有功能，其中酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：(i)非毒害植物的物质选自：对非绿色组织有直接植物毒性的非膦酸酯除草剂的酯衍生物，D氨基酸，非蛋白质D氨基酸的肽衍生物，

2、芳氧基苯氧丙酸类的S对映体和芳氧基苯氧丙酸的酯衍生物的S对映体，和(ii)酶选自：羧酸酯酶、D氨基酸氧化酶、D氨基酸脱氢酶、D氨基酸消旋酶、2芳基丙酰CoA差向异构酶、甲酰基CoA消旋酶、硫酯酶和酰基CoA合成酶。权利要求(20)1.一种生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：用多核苷酸转化植物材料，该多核苷酸编码至少一种与非毒害植物的物质反应产生毒害植物的物质的酶，和将由此转化的材料再生为植物，其中不超过雄性或雌性配子形成和/或成熟的时期，向所述植物施用所述非毒害植物的物质，使得非毒害植物的物质提供毒害植物的物质的产生，该毒害植物的物质选择性地阻止所述配子的形成或使其没有功能，其中所述

3、酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：(i)非毒害植物的物质选自：对非绿色组织有直接植物毒性的非膦酸酯类除草剂的酯衍生物，D-氨基酸，非蛋白质D-氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸类的酯衍生物的S-对映体，和(ii)所述酶选自：羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶。2.如权利要求1所述的方法，其中所述非毒害植物的物质与至少一种另外的物质一起混合施用，所述另外的物质选自：安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导物、细胞色素P450诱导物、除草剂、肥

4、料、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。3.如权利要求1或2所述的方法，其中叶面施用非毒害植物的物质，且该非毒害植物的物质是所述酶的韧皮部可移动的和代谢稳定的可氧化底物，其中该酶提供了做为来源于非毒害植物物质的直接或间接产物的毒害植物的产物。4.如前述权利要求所述的方法，其中毒害植物的产物是以过氧化物和/或超氧阴离子形式产生的间接产物。5.如权利要求3或4任一权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是D-氨基酸，其选自：D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-甲硫氨酸、D-丝氨酸、D-亮氨酸和D-异亮氨酸，所述的酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，其氧化所述氨基

5、酸为2-酮酸，同时伴随着氧原子还原为过氧化物阴离子。6.如权利要求3或4任一权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是D-天冬氨酸或D-谷氨酸，所述酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，其氧化所述的氨基酸为2-酮酸，同时伴随氧还原为过氧化物阴离子。7.如前述权利要求所述的方法，其中酶是从纤细红酶母(Rhodotorulagracilis)获得的突变D-氨基酸氧化酶，该氧化酶与野生型序列相比，在位置213和/或238包含置换，或者是D-天冬氨酸氧化酶。8.如前述权利要求所述的方法，其中从红酵母属(Rhodotorula)获得的氧化酶在位置213具有选自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的

6、氨基酸，和/或在位置238具有选自His，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸。9.如权利要求3-8任一权利要求所述的方法，其中所述酶不靶向过氧化物酶体。10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是羧酸酯酶，非毒害植物的物质是咪草酸的酯或氟燕灵的酯。11.如前述权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是咪草酸甲酯，氟燕灵甲酯或氟燕灵异丙酯，植物是小麦或本身同样对咪草酸甲酯，氟燕灵甲酯或氟燕灵异丙酯基本上不敏感的植物。12.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸消旋酶，非毒害植物的物质是膦丝菌素的D对映体或双丙氨酰膦的D对映体。13.如权利要求

7、1或2所述的方法，其中非毒害植物的物质包含在混合物中，该混合物含有毒害植物的物质，其中酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，所述酶能将氨基酸氧化为2-酮酸，同时伴随氧还原为过氧化物阴离子。14.如前述权利要求所述的方法，其中酶是从纤细红酶母(Rhodotorulagracilis)获得的突变D-氨基酸氧化酶，该氧化酶与野生型序列相比在位置213和/或238包含置换，或者是D-天冬氨酸氧化酶。15.如前述权利要求所述的方法，其中从红酵母属(Rhodotorula)获得的氧化酶在位置213具有选自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸，和/或在位置238具有选自His，Ser，Cys，

8、Asn和Ala的氨基酸。16.如权利要求13-15任一权利要求所述的方法，其中混合物包含D和L膦丝菌素，并且植物材料基本上仅在绿色组织中和产生配子的花组织中表达PAT基因，该配子不是那些使得其没有功能的配子。17.如权利要求1或2所述的方法，其中酶选自：2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶，其中非毒害植物的物质是芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸酯类的S-对映体。18.如前述权利要求所述的方法，其中所述的芳氧基苯氧丙酸的S-对映体选自：S-吡氟禾草灵、S-喹禾灵、S-喔草酯、S-吡氟氯禾灵、S-噁唑禾草灵、S-氟甲草、S-Cyhalof

9、op和S-炔草酯。19.一种产生对映体纯的D-膦丝菌素(D-PPT)的方法，包括步骤：(a)提供包含酶的细胞，该酶具有选择性N-酰化PPT的能力；(b)在含有D-LPTT的培养基中生长所述细胞以产生条件培养基；(c)从(b)的条件培养基分离细胞；(d)可选地，在各种pH，用非水性、非混溶的溶剂萃取条件培养基，使得含有PPT的级份与含有水溶性比PPT大的分子的级份分离；(e)可选地，以足以从培养基吸附相当比例除PTT外的阳离子的量和pH，混合质子化形式的阳离子交换树脂和条件培养基或步骤(d)的含有PPT的萃取培养基；(f)以足以结合培养基中大部分PPT的量和pH，混合质子化形式阳离子交换树脂和条

10、件培养基、萃取培养基或来源于步骤(e)的培养基，(g)收集步骤(f)的PPT结合的阳离子离子交换树脂，并且利用有足够pH和离子强度的洗脱介质从该树脂选择性洗脱PPT，条件是所述洗脱介质的pH不至于低到引起由此洗脱的PPT外消旋化。20.具有至少98.5对映体过量的D-PPT。说明选择性产生雄性或雌性不育植物的方法背景技术农作物植物中的杂种优势对产量提高有显著的影响。一般地，杂种与非杂种品种比较显示了增加的产量。杂种通常给予生长因子诸如水和肥料更多的回报单元(returnunit)。杂种常常提供优良的胁迫耐受性、产量和成熟的一致性，也提供了联合以其它方式难以联合的特性或性状的简单育种机会。通常，

11、植物中的杂种优势对于保证商业性开发足够重要。商用杂种广泛地用于许多农作物包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和芸苔中。然而，主要是由于缺少经济性杂种种子的生产方法，所以主要还是以近亲交配培育小麦、大麦和水稻。传统地，杂种种子生产涉及以一定行距种植分开区块的雌性和雄性亲本系，仅收获雌性亲本的种子。为了确保该种子是杂种，必需通过使得该株系雄性不育来最小化雌性亲本系的自花授粉。使得雌性亲本株系雄性不育的方法包括机械、化学和遗传方法。在雌雄同株植物，诸如玉米中，通过去雄雄性花序可以机械地、容易地获得雄性不育。然而，大多数农作物是雌雄异株，并且在相同的花朵中具有雄性和雌性器官，这使得这种物理去雄不实际。因此有时

12、利用遗传方法。出现的遗传雄性不育性状正常地受核基因控制，核基因中通常相对于相应的能育相关的等位基因，不育表型相关的等位基因隐性地表达。遗传雄性不育出现时正常地与单个隐性基因相关，而为了表达雄性不育，该单个隐性基因必需是纯合的。为了实际利用这种遗传雄性不育性状，育种者通常开发表型一致的雌性株系，该雌性株系分离为雄性不育和雄性能育植物。一旦鉴定雄性能育植物，就需要去劣，这是费力的。因为雄性能育植物是种群维持所必需的，所以不能从种群中排除它们，所以维持亲本株系总是存在问题。除了依赖于天然雄性不育等位基因的存在，也可以利用分子生物学的方法。可以基因工程改造植物，使得植物表达例如反义或核酶基因，该反义或

13、核酶基因减少或消除了能生育的花粉形成必需的关键基因的表达。这种转基因的植物株系是雄性不育的，并且通过利用来源于雄性可育植物的花粉杂交，用于杂种种子的生产。这种株系的主要问题是通过它们与等基因可育株系杂交，它们在随后世代中只能维持杂合状态。这在产量是至关重要的杂种种子生产中可能是个问题。尽管，例如，通过连接除草剂抗性和雄性不育，可以选择性去劣雄性可育植物，但是仍旧必需在最初以超高的密度种植植物。胞质雄性不育用于商业杂种生产需要稳定的雄性不育胞质和花粉来源。雄性不育的胞质遗传系统需要3种类型用于杂种生产的株系存在，A株系(胞质雄性不育)，B株系(雄性可育维持系)和R株系(具有恢复系基因的雄性可育)

14、。该系统产生的三方面杂交涉及4种株系的维持和产生，一种近交的A和B株系，其它两种株系的雄性可育近亲交配。依靠单一来源的雄性不育胞质可能最小化育种灵活性，并且产生对特定疾病具有大规模敏感性的后代。也可以通过抑制能生育的花粉形成的化学试剂的应用生产杂种种子。这些化学试剂称为杀配子剂，用于赋予短暂的雄性不育。但是杀配子剂的费用、注册性和可靠性限制了它们的应用。传统杂种种子生产系统的缺点是需要分开种植成排或成区块的雄性和雌性亲本株系。这里，低效率的授粉是农作物物种，诸如小麦中特别棘手的问题，这种物种释放不能随风漂移很远的小量的花粉。在这种农作物中，多达三分之二的杂种生产田地需要专门用于雄性花粉供体植物

15、，因此杂种种子生产变得不经济。为了在小麦和其它农作物中获得更经济的种子生产，必需移动雄性和雌性植物使得它们更靠近以进行更有效的花粉转移；通过在同一排中相互间隔几厘米间作雄性和雌性植物，以进行最有效的花粉转移。在这种系统中，仅从(雄性不育)雌性亲本收获种子不实际。通过在种植混合中利用尽可能低百分数的这种雄性亲本植物和/或通过利用雌性不育的雄性植物可以最小化来源于雄性亲本的非杂种种子的污染。尽管已经描述了构建显性雌性不育株系的方法(EP412,006A1(1990)；Goldman等，(1994)EMBO.J.，13，2976-2984)，但是，如同雄性不育株系一样，该株系必需保持为杂合子。因此，

16、需要杂种种子生产的简单、经济的方法。特别地，为了有效地生产杂种种子，需要提供可以作为纯合株系容易维持并且可用于有效的杂种种子生产的雄性不育雌性亲本株系和雌性不育雄性亲本株系。现有技术中所述用于达到该目的的方法包括这样的方法：其中从雄性和雌性亲本株系生产杂种种子，该雄性和雌性亲本株系的至少一个亲本株系包含优先地在花组织中表达的异源嵌合基因，其根据非毒害植物的物质的外源施用，有条件地使得该株系不育，该非毒害植物的物质可以被异源嵌合基因编码并且优先地在雄性或雌性生殖结构中表达的酶特异地和局部地转化为毒植物素。非毒害植物的物质可以是除草剂前体。具有这种有条件不育亲本株系的优点是它使得它们能够做为关于不

17、育性性状的纯合子维持。只有外源施用非毒害植物的物质时，才破坏了可育性。在一个这种条件性雄性不育性系统的例子中，编码脱乙酰基酶的基因优先地在雄性花组织的花药毡绒层细胞中表达，在该细胞中，它转化外源施用的除草剂前体N-乙酰L膦丝菌素为毒植物素L膦丝菌素，因此，阻止能生育的花粉形成。在另一个相似例子中：(i)细菌细胞色素P450的毡绒层优先表达催化除草剂前体R7402转化为阻止能生育的花粉产生的磺脲毒植物素和(ii)膦酸单酯水解酶的毡绒层优先表达催化甘油草甘磷除草剂前体转化为毒植物素草甘磷，其也阻止能生育的花粉的产生。WO98/03838描述了有条件雌性不育性系统的例子，其中能将除草剂前体转化为毒植

18、物素的酶优先在雌性生殖结构中表达。尽管存在生产有条件不育的雄性和雌性亲本系的这些方法，但是在农作物诸如小麦中，杂种种子的生产远远没有常规化。本发明涉及，尤其是现有技术中关于有条件雄性不育的雌性亲本系和有条件雌性不育的雄性亲本系产生的改进。发明内容本发明涉及作物杂种种子生产方法的改进。特别地，本发明涉及从雄性和雌性亲本系生产杂种种子的方法，其中该雄性和雌性亲本系的至少一个亲本系是有条件雌性或雄性不育，该有条件雌性或雄性不育取决于对作物是非毒害植物性的物质的外源施用，该物质包括除草剂前体。本发明还涉及在一定时期和以足够的量施用所述非毒害植物的物质的方法，其中该时期和足够的量能够最小化或阻止有条件不

19、育亲本系中的自花受精。本发明也涉及也涉及产生有条件雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括：i)用单独或一起编码一种或多种酶的一种或多种嵌合基因转化植物材料，所述酶具有与优选地为除草剂前体形式的非毒害植物的物质反应以产生毒害植物物质的能力。酶在一个或多个启动子可操作控制下表达，其中在有条件雄性不育植物的情况下，所述启动子引起酶优先在雄性生殖结构中表达，或者在有条件雌性不育植物的情况下，所述启动子引起所述酶优先在雌性生殖结构中表达。植物材料再生为有条件雄性或雌性不育的形态学正常的可育植物。本发明也包括有条件雄性不育植物联合有条件雌性不育植物以更有效生产杂种种子的用途，一些除草剂前体做为非毒害植物的物

20、质的用途，和嵌合基因更有效地生产杂种种子的用途，用于本发明的嵌合基因和酶。本发明也提供了有条件雄性不育，有条件雌性不育植物，这些植物的种子和通过该方法生产的杂种种子。在本发明优选的实施方式中，生产杂种种子的方法应用的农作物植物是玉米、稻、高梁、小麦、黍、燕麦、芸苔(canola)和大麦。根据本发明，提供了生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：用编码至少一种酶的多核苷酸转化植物材料，该酶与非毒害植物的物质反应以产生毒害植物的物质，并且将由此转化的材料再生为植物，其中不超过雄或雌配子形成和/或成熟的时间，给植物施用所述非毒害植物的物质，这样非毒害植物的物质提供了毒害植物物质的产生，该毒害植

21、物物质选择性阻止所述配子形成，或者以其它方式使得所述配子没有功能，其中该酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：(i)非毒害植物的物质选自：对非绿色组织是直接毒害植物性的非膦酸酯除草剂(non-phophonateherbicides)的酯衍生物，D-氨基酸，非蛋白质D-氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸类的酯衍生物的S-对映体，和(ii)酶选自：羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶。因为期望的目的是最大化杂种种子产量和因此最小化任何农作物的损害，所

22、以在优选的实施方式中，非毒害植物的物质是除草剂前体，该除草剂前体选自对农作物相对非毒害植物的化合物。为了能够具有抗花组织的作用，也期望除草剂前体是在“非绿色”组织中有效的毒植物素的前体。因此，在本发明优选的实施方式中，除草剂前体选自是毒植物素前体的那些除草剂前体，该毒植物素对非绿色组织具有直接植物毒性，而不是在光合作用或在光合作用色素产生中具有主要作用位点的那些。最小化杂种种子生产的花费也是期望的目的。因此，在优先的实施方式中，除草剂前体选自化学物质，该化学物质用在农作物中已经得到或正在受到适合的管理机关批准。术语：定义这里所用“基因”指包含几个可操作地连接的DNA片段的任何DNA序列，所述D

23、NA片段是诸如启动子和5调节区，编码区和包含聚腺苷酸化位点的非翻译3区。“嵌合”当指基因或DNA序列时，用于指在自然界中，编码序列不与基因中DNA的启动子或至少一个其它调节区相关的事实。这里所用“嵌合基因”指一种基因，其中在自然界中，其编码序列不与基因中DNA的启动子或至少一个其它调节区相关。这里所用的“表达盒子”指可转移的DNA区，包含侧翼有一个或多个限制或其它位点的嵌合基因，所述位点有利于从一个DNA基因座精确地切除并且插入另一个DNA基因座。本发明上下文中“非毒害植物的物质”是对本发明方法应用的任何特定农作物的植物、细胞或组织相对非毒害植物的物质。非毒害植物的物质不需要在所有植物的所有植

24、物组织中都是非毒害植物的。非毒害植物的物质包括除草剂前体物质，该除草剂前体是对植物组织没有明显直接毒性作用的物质，但是它是活性毒植物素的前体。在敏感植物物种中，通过植物中将这种除草剂前体转化为毒植物素的内源酶作用，这种除草剂前体间接地做为除草剂。在本发明上下文中“毒植物素”是本发明方法应用的特定农作物的植物、植物组织和植物细胞具有毒性的物质。这种毒植物素不需要对所有植物物种的所有植物组织都是植物毒性的。“雌性生殖结构”意指雌配子和那些专门用于雌配子产生、成熟和生育力的植物部分。通常地，该定义包括包含心皮或雌蕊群(“雌蕊”)的植物部分。植物的心皮包括但不限于柱头、花柱、子房和柱头、花柱、子房包含

25、的细胞或组织。“雄性生殖结构”意指雄配子和专门用于雄配子产生、成熟和生育力的植物部分。该定义包括包含，例如小孢子、雄蕊、绒毡层、花药和花粉的植物部分。这里所用的“雌性不育植物”是当有功能或能生育的花粉给其授粉时，不能支持能生育的种子形成的植物。这种雌性不育性可以是育种选择或转基因存在的结果。“有条件雌性不育植物”指在正常生长条件下是雌性可育，而在特定条件下可以变成雌性不育的植物。在本发明上下文中，所述条件包括除草剂前体或其它非毒害植物的物质的外源施用。在发明上下文中，这种“雌性不育植物”或“有条件雌性不育植物”保留了雄性可育并且能够产生能生育的花粉。这里所用“雄性不育植物”是不能支持能生育的花

26、粉形成的植物。这种雄性不育性可以是育种选择或转基因存在的结果。“有条件雄性不育植物”指在正常生长条件下是雄性可育，而在特定条件下可以变成雄性不育的植物。例如所述条件可以包括物理去雄或特定化学杀配子剂的施用。在本发明上下文中，所述条件特别地包括除草剂前体或其它非毒害植物的物质的外源施用。在本发明上下文中，这种“雄性不育植物”或“有条件雄性不育植物”保留了雌性可育并且当有功能或能生育的花粉给其授粉时，其能够产生能生育的种子。这里所用的“启动子区”是包含至少功能性启动子和可选地一些或所有它的相关上游调节序列和/或相关下游序列的DNA区，该上游调节序列包含增强子序列，该下游序列包含启动子内源性基因的一

27、些或所有5非翻译区。这里所用“间作”指在大田中种植植物或种子的方法，该方法确保雄性可育植物对雄性不育或有条件雄性不育植物的充分异花授粉。通过种植前，以不同的混合比例(80/20；90；10；等)随机混合雌性和雄性亲本种子，或者通过以特定的田地模式种植，由此使得不同种子交替可以达到该目的。当需要分开收获不同植物时，优选以交替区块或排种植。这里所用的“羧酸酯酶”仅仅包含正确分类为EC3.1.n的酶。在本发明方法中，所述非毒害植物的物质可以与至少一种其它物质一起以混合物形式施用，所述物质选自氨基酸、安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导物、细胞色素P450诱导物、肥料、除草剂、杀线虫剂、增效剂、

28、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。在特定实施方式中，所述非毒害植物的物质可以与胡椒基丁醚或马拉硫磷以混合物形式施用。在特定实施方式中，所述非毒害植物的物质可以与相同的毒害植物物质以混合物形式施用，其中所述非毒害植物的物质是毒害植物物质的前体。本发明方法中所用的酶可以是羧酸酯酶，非毒害植物的物质可以是咪草酸(imazamethabenz)或氟燕灵(flamprop)的酯。在具体涉及小麦的本发明特别优先的形式中，非毒害植物的物质是除草剂前体，该除草剂前体选自：咪草酸甲酯(imazamethabenzmethyl)，氟燕灵甲酯(flampropmethyl)或氟燕灵异丙

29、酯(flampropisopropyl)。所述酶可以是D-氨基酸氧化酶，D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸消旋酶，此时非毒害植物的物质可以是D氨基酸，特别地，它可以是膦丝菌素的D对映体，双丙氨酰膦的D对映体，或者选自D-丙氨酸、D丝氨酸、D异亮氨酸、D甲硫氨酸、D亮氨酸或D缬氨酸。这里所用“D-氨基酸氧化酶”意指能氧化D-氨基酸以产生2酮酸的任何酶，并且包括对天冬氨酸特异的酶，称为“D-天冬氨酸氧化酶”。做为替代技术方案，本发明方法中所用的酶选自：2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶，那么非毒害植物的物质可以是芳氧基苯氧丙酸的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸

30、酯的S-对映体。编码酶的嵌合基因可以选自包含DNA编码序列的基因，其中该酶具有单独或与其它物质联合与非毒害植物的物质反应产生毒害植物物质的能力，该DNA编码序列编码一种或多种下面的酶：(1)能催化水解反应的羧酸酯酶：(2)能催化水解反应的羧酸酯酶：和/或(3)能催化氧化反应的D-氨基酸氧化酶：和在一些实施方式中，特别地是反应(4)能催化氧化反应的D-氨基酸脱氢酶：D-氨基酸脱氢酶可以是膜相关酶，该膜相关酶通过电子受体将电子与结合膜的电子传递链偶联，通过该电子传递链，最终的电子受体可以是，例如NAD+或O2。(5)能催化相互转化的氨基酸消旋酶：D-膦丝菌素<>L-膦丝菌素(6)能催化

31、下面一种或多种反应的2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或-甲基酰基-CoA消旋酶：S-吡氟禾草灵-CoAR-吡氟禾草灵-CoA和/或S-喹禾灵-CoAR-喹禾灵-CoA和/或S-喔草酯-CoAR-喔草酯-CoA和/或S-吡氟氯禾灵-CoAR-吡氟氯禾灵-CoA和/或S-噁唑禾草灵-CoAR-噁唑禾草灵-CoA和/或S-氯甲草-CoAR-氯甲草-CoA和/或S-Cyhalofop-CoAR-Cyhalofop-CoA和/或S-炔草酯-CoAR-炔草酯-CoA(7)能催化水解反应的硫酯酶：和/或和/或和/或和/或和/或和/或和/或(8)能催化下列反应的酰基-CoA合成酶：和/或和/或和/或和/或和/或

32、和/或和/或和/或所述羧酸酯酶可以选自羧酸酯酶B(EC3.1.1.1)类型酶，特别是来源于节杆菌属(Arthrobactersp)，芽孢杆菌属(Bacillussp)，猪肝脏，酵母属(Saccharomycessp)或集胞藻属(Synechocystissp)的羧酸酯酶。优选的这种酶可以选自具有Swissprot记录号Q01470，P37967，Q29550(来源于60-1703的成熟肽序列)，P40363或SEQIDNo.2(本申请)的蛋白质，并且编码羧酸酯酶的DNA序列可以选自包含在EMBL记录号M94965，BS06089，SSCE，Z34288和SEQIDNo.1(本申请)中的DNA序

33、列。适于本发明使用的其它羧酸酯酶和DNA编码序列从植物和微生物中选择，在基本培养基中，所述植物和微生物被发现对咪草酸甲酯的生长抑制显示了和对咪草酸的生长抑制相似的敏感性。利用适合的DNA探针鉴定这种生物体DNA文库的候选酯酶基因，并且通过亚克隆分离该候选酯酶基因。做为可替代的方案，通过筛选咪草酸甲酯敏感表型的转化体，从适合的咪草酸甲酯不敏感宿主生物体中的表达文库鉴定和筛选编码适合的酶的基因。同样地，可根据大肠杆菌(E.coli)中的表达，并且在体内或体外，通过常规的方法检测期望的氟燕灵酯或咪草酸酯(imazamethabenzester)的酯酶活性，筛选适合和改进的基因和酶，该常规方法包括通过

34、靶酶诸如乙酰醇酸合酶的抑制，通过HPLC/UV和/或通过衍生化和GCMS检测灭草烟或氟燕灵。D-氨基酸氧化酶(DAMOX)可以选自红冬孢属(Rhodosporidiumsp)(红酵母属(Rhodotorulasp)，三角酵母属(TrigonopsisSp)，猪，镰刀菌属(FusariumSp)，假丝酵母属(CandidaSp)，裂殖糖酵母属(SchizosasaccharomycesSp)，和轮枝孢属(VerticilliumSp)，并且可以选自具有对应于Swissprot记录号P80324，Q99042，P00371，P24552或SPTREMBL号Q9HGY3和Q9Y7N4的序列的蛋白质。

35、编码D氨基酸氧化酶的DNA序列可以选自包含在EMBL记录号A56901，RGU60066，Z50019，SSDA04，D00809，AB042032，RCDAAOX，A81420和SPCC1450中的序列。D-氨基酸氧化酶是遍在黄素酶。在非毒害植物的物质是D-膦丝菌素或D-双丙氨酰膦或D-天冬氨酸或D-ghitamate情况下，特别优选的D-氨基酸氧化酶获自纤细红酶母(Rhodotorulagracilis)突变体或是D-天冬氨酸氧化酶。无论非毒害植物的物质是什么，当这种突变体与野生型序列比较时，其都可以在213和238位置含有单或双氨基酸置换。优选地，在位置213，用Arg，Lys，Ser，

36、Cys，Asn或Ala置换野生型甲硫氨酸，而在位置238，用His，Ser，Gys，Asn或Ala置换野生型Tyr。然而，所述酶可以在前段提到的位置以外还包含其它置换，或者在不同于前段提到的位置包含置换。特别地，可以用选自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp，优选是His，Ser或Ala的残基置换在野生型序列位置58的Phe。此外，或做为可替代方案，可以用选自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp，优选是Ser或Ala的残基置换在野生型序列位置213的Met。此外，或做为可替代的方案，可以用选自His，Ser，Ala，Arg和Asp的残基置换在野生型序列位置223的Tyr。此

37、外，或做为可替代的方案，可以用选自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp的残基置换在野生型序列位置238的Tyr。该酶特别优选的突变体形式包含至少2种上述突变。这种双突变体的第一实施方式在位置58有His(而不是野生型序列中的Phe)，在位置213有Ser(而不是Met)。这种双突变体的第二实施方式在位置58有Ser(而不是野生型序列中的Phe)，在位置213有Arg(而不是野生型Met)。在非毒害植物的物质是D-氨基酸，但不是D膦丝菌素或D-双丙氨酰膦的情况下，那么酶是D-氨基酸氧化酶。优选地，D-氨基酸不是内源植物代谢物，并且选择韧皮部可移动、在植物中代谢稳定(优选地，在植物中具有

38、约1周以上的t1/2)和是所述氧化酶有效底物的D-氨基酸。酶的D-氨基酸氧化作用伴随着氧还原为毒害植物的过氧化物和/或超氧阴离子的还原作用。在优选的实施方式中，氧化酶靶向过氧化物酶体外的亚细胞位置。例如，通过修饰基因以缺失或修饰3个C-末端氨基酸(例如，在纤细红酶母(Rhodotorulagracilis)D氨基酸氧化酶的情况下是SKL)，和/或通过向N-末端添加叶绿体或线粒体转运肽的序列可以达到该目的。通过本领域技术人员已知和本发明公开扩充的突变和筛选方法，优选地可以从真菌来源获得其它适合的D氨基酸氧化酶。适于本发明使用的其它D氨基酸氧化酶(或同样地，膦丝菌素消旋酶)和DNA编码序列选自生物

39、体，可选地经过诱变的生物体，其中发现在D-膦丝菌素存在的情况下，在诱导D-氨基酸氧化酶(或膦丝菌素消旋酶)的条件下，N限制性培养基上的生长选择性地受到抑制。因此，例如，通过用适合的简并DNA探针(例如，根据确定的D-氨基酸氧化酶共有序列诸如PROSITE，PS00677)探测杂交这种生物体的基因文库，和亚克隆，可以获得适于本发明的D-氨基酸氧化酶基因。做为可替代的方案，通过筛选基本培养基上转化为对D-膦丝菌素的生长抑制具有增加敏感性表型的适合宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母(适合的宿主株系缺少对D-膦丝菌素的内源氧化酶或脱氢酶活性)中基因表达文库，获得编码适合的酶的基因。该方法取决于

40、转化的大肠杆菌(E.coli)克隆通过它们内源L转氨酶活性和异源氧化酶的联合作用，从D-PPT产生L-PPT的能力。做为可替代的方案，根据所表达酶氧化D-膦丝菌素期望能力的体外测定筛选适合和改进的基因。存在许多直接测定D-氨基酸氧化酶活性的方法，诸如基于过氧化物(EnzymeMicrob.Technol.，(2000)，27(8)，605-611)的测定，利用氧电极的氧消耗的测定法或基于氨的直接测定法。在本发明实施方式中，将优选真菌来源的DAMOX基因克隆到启动子(例如，GAL启动子)可操作控制的穿梭载体中，该启动子能够在将要进行筛选的宿主生物体(优选酵母)中表达。然后，例如通过Mn2+-有毒

41、PCR，在DNA修复/编辑过程缺陷的株系诸如大肠杆菌(E.coli)株系XL1red中进行质粒DNA复制，或者通过在利用，例如X射线、UV光线、化学诱变剂添加经过诱变的宿主株系中进行质粒DNA复制对该基因进行诱变，并且将其转化到宿主生物体(优选酵母)中。通过例如以下方式筛选具有增强的氧化D-PPT能力的期望特性的编码DAMOX的期望DNA(这在基于穿梭载体中存在的选择性标记的可选的，最初的转化体筛选步骤之后进行，所述筛选步骤允许，例如通过在潮霉素存在情况下的生长或原养型的恢复进行筛选)：(a)筛选有能力利用作为唯一氮源的氨基酸的转化细胞，该氨基酸与D-膦丝菌素化学上相似。例如，筛选在作为唯一氮

42、源的D-PPT(和其酯)的类似物上能生长的转化酵母菌落，在D-PPT(和其酯)类似物中，用羧酸(即，D-谷氨酸)、磺酸、膦酸、砜或亚砜部分(或它们的酯)置换次膦酸(phosphinicacid)部分。例如未提供图片。查看 PDF(b)筛选能利用D-PPT本身做为唯一N源的转化细胞。为了进行该筛选，还必需使用能使L-膦丝菌素对谷氨酰胺合成酶抑制作用无效的基因转化宿主细胞。例如穿梭载体也可以包含编码酶诸如失活L-PPT的PAT的基因。可以重复突变和筛选的循环。可以进行克隆、表达、部分纯化和动力学表征D-氨基酸氧化酶以鉴定具有最适特性(例如，酶稳定性、D-PPT氧化作用的高kcat/Km值、任何内源

43、植物底物的最小氧化作用、最适宜pH等)的基因和DAMOXs。在非毒害植物的物质是D-膦丝菌素(PPT)的情况下，可以从D和L-PPT混合物获得它。可以向大肠杆菌(E.coli)细胞(可选地，最小化N-乙酰PPT脱乙酰基酶活性背景水平的argE突变体)的(优选基本)培养基添加DLPPT，所述大肠杆菌被转化并且以高水平诱导表达PAT基因(编码从乙酰CoA转移乙酰基到L-PPT的酶)。在(例如，通过利用31-PNMR监测转化判断)使得L成分基本所有都是N-乙酰化的适合时间后，利用连续步骤，例如，在高和低pH的溶剂萃取，阴离子和阳离子交换层析，用手性阳离子诸如chinchocine的选择性结晶作用，或

44、本领域已知的其它方法诸如具有两个非混溶含水相做为相系统的液体/液体萃取(参见，USP5,153,355中的方法)，从无细胞培养基回收和纯化D-PPT。做为可替代方案，可以通过酶促方法获得D-PPT，在该方法中通过(I)L-氨基转移酶(例如，来源于大肠杆菌(E.coli)和(II)谷氨酸脱羧酶的联合作用，将DLPPT+2酮戊二酸转化为主要是DPPT，2-氧代PPT(和其脱羧基产物)和GABA的混合物。利用本领域已知和上文概述的方法，从反应混合物解析期望的纯DPPT。D-PPT也可以用酶促方法获得，在该方法中，通过(I)L-氨基转移酶和(II)谷氨酸脱氢酶的联合作用将DLPPT+2酮戊二酸+NAD

45、转化为主要是D-PPT、2-氧代PPT(和其脱羧化产物)NADH和氨的混合物。目的D-PPT从反应混合物中纯化。在产生D-PPT的另一个方法中，用L-氨基酸氧化酶处理DLPPT，这样仅仅保留了期望的D形式氨基酸。然后，从反应混合物纯化该D-PPT。另一个方法包括(I)转化DLPPT为N-乙酰DLPPT(利用本领域熟知的醋酸酐或其它乙酰化试剂和方法)和(II)用D-氨酰化酶处理N-乙酰DLPPT，这样仅N-乙酰DPPT脱乙酰化。从反应混合物纯化由此得到的D-PPT。例如，通过结合至Dowex阴离子交换树脂和用40mM甲酸洗脱，从N-乙酰-L-PPT解析D-PPT。在适合的加样条件下，该酸洗脱D-

46、PPT，而留下与结合柱子的N-乙酰-L-PPT。另一个方法包括在非水溶剂中，用L-氨基酰化酶和酰化试剂处理DLPPT，这样仅留下非乙酰化形式的期望D-PPT。制备纯D-PPT的另一个方法包括利用手性碱(chiralbase)诸如chinchocine和纯D-PPT和手性碱的晶种的添加，从DLPPT的对映体选择性结晶作用。从DL-PPT制备纯D-PPT的另一种方法利用手性碱柱子，通过直接手性层析。在下面的一个实施例中给出了纯D-PPT产生的详细方法。2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或-甲基酰基-CoA消旋酶(EC5.1.99.4)可以选自：通过大鼠肝脏、支顶孢属(Acremomiumsp)或粗糙脉

47、孢菌(Neurosporacrassa)产生的这种酶。2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或-甲基酰基-CoA消旋酶(EC5.1.99.4)可以选自：具有对应于GENESEQPDerwent数据库中AAR49827，Swisspro中P70473或SEQIDNo.4(本申请)的序列的蛋白质，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或-甲基酰基-CoA消旋酶(EC5.1.99.4)可以由下列DNA编码序列编码，所述DNA序列选自：包含在GENESEQNDerwent数据库记录号AAQ44447，EMBL记录号RN2ARYLCO和RNU89905和SEQIDNo.3(本申请)中的序列。本发明所用的酰基CoA合成酶

48、可以是“长链”酰基CoA合成酶(EC6.2.1.3)，其选自：欧洲油菜(Brassicanapus)，大鼠肝脏，酵母属(Saccharomycessp)或拟南介属(Arabidopsis)产生的那些酶。所述合成酶可以选自：具有对应于SPTREMBL序列Q96338，SwissprotP18163，SwissprotP39518，SPTREMBLQ9C5U7或SPTREMBLQ9TOAO的序列的蛋白质，而编码酰基CoA合成酶的DNA序列可以选自：包含在EMBL记录号BNAMPBP2，J05439，X77783和AB030317中的序列。可以根据来源生物体转化S-芳氧基苯氧丙酸类为R-芳氧基苯氧丙

49、酸类和/或转化S-ibuprofen为R-ibuprofen的能力，选择适于本发明所用的酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶和硫酯酶和/或编码它们的DNA序列。例如，可以从土壤样品获得这种生物体，并且本领域熟知细胞培养物和微生物肉汤中测定和检测这种手性转换的方法(参见，Menzel-Soglowek等，(1990)J.Chromatogr.，532,295-303；Bewick(1986)Pestic.Sci.，17，349-356)。因此，酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶和/或硫酯酶，和可选地编码它们的DNA序列可以来源于：简单节杆菌(4rthrobactersi

50、mplex)NCIB8929；玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacterroseoparaffineus)ATCC15584；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC15841；灰葡萄孢(Botrytiscinerea)CM1124882；BrevibacteriumbutanicumATCC15841；希氏短杆菌属(Brevibacteriumhealii)ATCC15527；酮戊二酸短杆菌(Brevibacteriumketoglutamicum)ATCC21004；BrevibacteriumparaffinolyticumATCC21195；束棒杆菌(Corynebac

51、teriumfascians)；CorynebacteriumfijikoenseATCC21496；MethanomonasmethanolicaNRRLB-5758；玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)；金色分枝杆菌(Mycobacteriumaurum)NCTC1043；嗜石油分枝杆菌(Mycobacteriumpetroteophilum)ATCC21497；草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)NCTC10266；耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)ATCC19420；不透明诺卡菌(Nocardiaopaca)NCIB9409；Noc

52、ardiopsisasteroidsATCC21943；缺陷假单孢菌(Psuedomonasdimimuta)NCIB9393；勒氏假单孢菌(Psuedomonaslemoignei)NCIB9947；紫红红球菌(Rhodococcusrhodocrous)ATCC13808；紫红红球菌(Rhodococcusrhodocrous)ATCC21197；红球菌属(Rhodococcussp)ATCC21499；和红球菌属(Rhodococcussp)ATCC31337。利用本领域熟知的方法，利用基于其它酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶和硫酯酶已知序列的适合简并的探针，容易从这些生

53、物体的适合基因文库克隆和筛选包含DNA编码序列的候选和改进基因。通过在适合宿主中制备表达文库，和利用体外或整个生物体培养测定法，筛选文库克隆进行全部手性转换的能力，或可替代地催化单个酰基CoA合成酶(利用微粒体部分)，2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或硫酯酶部分反应中每一个的能力，选择替代的和额外的适当基因。这些活性体外测定的适合方法与文献中所述用于ibuprofen的方法相似或相同(例如，Shieh和Chen(1993)JBC，268，3487-3493)。本发明方法中所用的酶可以是膦丝菌素消旋酶，通过谷氨酸消旋酶基因的诱变和/或重组改组，接着进行重复循环的筛选和向增加膦丝菌素消旋酶活性水平的

54、方向进化产生它的DNA编码序列。谷氨酸消旋酶普遍存在细菌中，并且具有两种类型，一种类型依赖于吡哆醛磷酸做为辅因子，另一种类型是辅因子依赖型，并且包含2个活性位点半胱氨酸残基。在本发明一个实施方式中，选择编码戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，溶血葡萄球菌(Staphylococcushemolyticus)和球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)谷氨酸消旋酶的序列用于突变和/或重组家族改组。在特定实施方式中，选定用于改组的基因编码具有对应于(Swisspr

55、ot)序列O82826，P94556和031332的序列的蛋白质。通过从适合的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母中的表达文库筛选那些菌落，选择适于本发明使用的基因，其中在基本培养基中该菌落对D-膦丝菌素生长抑制显示了增加的敏感性。L-PPT抑制谷氨酰胺合成酶，而D-PPT不抑制。除非补加谷氨酰胺，否则转化D-为L-PPT的谷氨酸消旋酶突变体克隆将不在基本培养基上生长。在适合的宿主株系中，不表达内源D-氨基酸氧化酶或D-氨基酸脱氢酶活性，或者该活性不包含D-膦丝菌素做为底物。做为可替代的方案，可以根据所编码酶互换D和L膦丝菌素能力的体外或体内测定，选择适合的基因。适合的这种测定法可以根据

56、-质子交换，检测从D-膦丝菌素到L-膦丝菌素形成的生物测定法的应用，或者，例如，利用与适合的D-氨基酸氧化酶偶联，L-膦丝菌素到D-膦丝菌素转换的检测。可选地，可以进一步突变和选择本发明所用编码酶的DNA序列，以产生具有改进效用的其它有用的酶。因此，改进酶的许多特性，包括对期望底物的催化活性(kcat/Km)，温度稳定性和最适宜pH。产生、筛选和选择这种改进的变异体的方法是公知的。例如，通过诱变方法(例如，通过UV，化学或靶向寡核苷酸PCR诱变，通过具有易错DNA复制的细菌或酵母株系，诸如大肠杆菌(E.coli)XL1red传代DNA)产生适合的变异体DNA序列。特别地，通过在例如WO0061

57、740，28-41页中概述的大量DNA改组或“有性PCR”替代方法中的任何一种方法产生这种基因，这里本发明参考文献包含这篇文献的所有内容。许多方法适于选择这种改进的基因。可以适合地在适合的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母中表达该基因，并且利用如，例如这里所述适合的这种测定法选择改进的该基因。能单独或与其它酶联合，转化非毒害植物的物质为毒害植物物质的本发明所用酶的编码嵌合基因每个都可以包含编码一种所述酶的DNA序列，该DNA序列可操作地连接5启动子区，该启动子区优先地将表达定向到雄性或雌性生殖结构。该表达特异性确保仅在能生育的种子或能生育的花粉形成所必需的组织和细胞位点中发挥所表达酶的

58、作用，并且在适合的非毒害植物的物质(可以是除草剂前体)存在的情况下，除了该表达酶对生育力的作用外，它不会对植物有害。除了启动子区外，本发明嵌合基因还可以包含3转录终止子序列。它负责转录终止和正确的mRNA聚腺苷酸化。本领域已知许多这种3转录终止子序列，并且其适于用在本发明嵌合基因中。在特定的实施方式中，3转录终止子序列选自：CMV35S终止子，tml终止子，胭脂氨酸合酶(nos)终止子和豌豆rbcSE0终止子。适于用在所述嵌合基因一些实施方式中的5启动子区包含优先在雌性花组织中表达的基因5区。在一些实施方式中，5启动子区选自：烟草stig1启动子(Goldman等，(1994)EMBOJ.，13，2976-2984)，修饰的S13启动子(Dzelkalns等，(1993)PlantCell，5，8555)，AGL5启动子(Savidge等，(1995)PlantCell，7，721-733)和玉米-心皮特异性ZAG2基因的5启动子区(Thiessen等，(1995)Gene，156，155-166)。可选地，从对应于本领域已知优先在雌性生殖结构中表达的cDNA序列的基因组DNA编码序列上游区获得其它适合的启动子区。在一些实施方式中，这种探针cDNAs选自：拟南介属