基因测序的前世今生(一代测序,二代测序,三代测序最详原理)

1、测序技术的前世今生测序技术的发展历程帥欧Hbd&ukiti HuhmurtiX.(ZQJD(R n | wJ；l 咖IWIIimniU诧亀ItrjIil 功 H-MiJi6*?!r j I !(ieXP(，訂泊iIlWThiJiunhvddNTPddNTP韻腹*料哥三(RmLAMaji 專 iiviMB第一代测序技术（San ger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（San ger）和考尔森（Coulson ）开创的链终止法 或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam ）和吉尔伯特（Gilbert ）发明的化学法（链降解） ，在 2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改

2、进了的San ger法为其测序基础。原理：ddNTP的3无羟基，其在 DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的 DNA序列。OFF THE HAIl标记模摄1 gdGTPdGTPdCTP+ 3dCTPdGTPdTTP+ddTTPIdTTPdTTP I-ATCGTldT-ATddC-ATCGTTddG-ATCGddT-ATGddGAddTI1f丈；拎哎逼丰亢TCGAdATP d

3、GTPdATPdGTP+ddGTP-ATCGTTGddA-ddAdATP+ddATP dGTP dGTP dTTP-ATCGTTGddAATCGTTddG-A TCGTddTATCGddT-ATCddG-ATddC-ddTctdAAGGCoTAGCAACTATCGTTGA引物征扶和合成爼斷第二代测序技术（NGS）第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达 99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和 ABI公司的Solid技术为标

4、记的第二 代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。1. illumina占全球75%以上,4步：Illumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器， 以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下OFF TK HA112ppiyDNA fragnwnli lo tlOMcellCluster geiwratian 刃 ftotd p

5、hase PCR (bndte amptrhcathGn)hipmvTiiEHMwW MMarti pun ffniiw DM r 鼻M*i 覽 tyi 401 * fU hHFfii曲fwri iM XJUUilWtaMlnH9M|fr4raAiywH wM4 N tnt- d Vvin iMl-Lf-fl rnr q “仁单忡厂巧严；乐1hflVPrs门gLr旧代4HuiUlJH*SM-Mv m qAukrIM讷 atrt chewyhtKincopKrd hMiff *IFW J 4iSequence raaticwr msrtlipic ihmiulTi1 2 q0H- epM cpc

6、te wqMnERdrunn 维*rifwna fWW* b|Mn flAffflfM * IMflthMt* II1R*E22DFF TW VA11（FkMr ullJ晦*“牆耻161*章tugI inr 1*-iU 2 *f （Cobmk 韵 L# 眄 t；r“IX U即.130宁*. Cd-ymn 1+-tolumn 2対呻矗丈Iftfz鼻Mifl怦桑牛週仃EH*创列帝GOT吓国附卞小M/i 扶sis耳矗崑申桃mnM&3）成簇（cluster）NGS的核心技术特点，目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到CCD镜头摄取荧光的信号要求。大体原理网上都可查到，在此解答2大难理解之处:

7、一可逆终止荧光 dNTP（lllumina测序核心技术）荧光修饰dNTP可逆合成终止（包括用叠氮基团 即起到了可逆终止作用和用不同荧光集团区 别碱基信号的功能），是Illumina测序的最核心技术。1.上图是修饰过的 dCTP分子结构式，在核苷酸糖基的3位连一个叠氮基团（红色基团）。这个叠氮基团在链延伸的时侯起到了阻止聚合 的作用（理解见下图 DNA复制时的5和3 的示意图，下一个碱基合上时是：下一个核苷酸的 5P连接到上一个核苷酸的30H，故如果下一个核苷酸的3带有叠氮基团而非自然状态下的OH时，下一个核苷酸就无法合上。）0(JAIK ucnr,E. jn?, to：, ;ti die Bl

8、izmuor, JATF)DNAO-P-O9LiMtcfelon jgont (LOSER) forma i ikuyrimidirw?ulycyI(Fjfi.单端测序（35cycles）:在完成桥式PCR后，把Read 1测序引物杂交到模板上之前，需要切 断桥式PCR所形成的双链中的一条，只留下单一的模板链，以作为模板，供下面的边合成、边 测序之用。方法：高碘酸希夫反应：过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基。UOHI0OH-原理：P5最后一个碱基 A的糖基的第4和第5位的C分别加入一个-OH （二羟基-diol，即构 成P5-diol-OH ），桥式PCR后用高碘酸钠溶液处理，高碘酸根快

9、速、精确地将二个醇基之间的那 个碳碳键切断，洗掉 P5相接的那条DNA链，当然，最后一个碱基A也被洗掉了，如下图：OVERVIEW OF THE METHODSoxoG - P71Grail irtg2. Cluster 日mp匚-fnulJli .fi dMTP block &7. Linearise p?Hyb SBS 8(FpgSBS READ-2-3- USER Linearisation 4 ddNTP block &Lt .Hyb SRS3SBS READ 1 III T11G -syntheEi& ci - ttrarid ttsoTtrermal amp)5 O&pho&pho

10、rylafaP5-PO (WK第一条链切断（在上图中的第2步）：第一次桥式PCR之后（25-28cycles）和单端测序中的那次切断的目标一样，是要留下双链中的一条，以作为read 1的测序模板。方法：通过在P5中加入一个U碱基（具体序列信息待查），而后在要切断这链链的时侯，用USERB（ Uracil Specific Excision Reage nt，尿嘧啶链特定切断试剂）来切一下。基化酶-裂解酶Endo VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切割，形成一个脱碱基（脱嘧啶）位点，但保持磷酸二酯骨架结构完整。Endo VIII的裂解酶活力使脱碱基位点3和5端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的

11、脱氧核糖。方法：甲酰胺基嘧啶糖苷酶，FPG对“-氧鸟嘌吟糖苷，8-oxo-G的选择性切断作用。P7的3末端最后一个 G被修饰为8-oxoguanine，是FPG的作用 位点，Fpg就把-oxo-G碱基切掉（步骤 A）,并把那条链给切断（步骤B）,剩下的结构是 P7的3末端有一个与上一个” 核苷酸的3-0H相连的磷酸基以及一个不完整糖基的磷酸基，也就是上图中，其5磷酸基团连接着上一个核苷酸的3端，所以此结构相当于Blocked P7接头的3，起到了阻止链延伸的作用。在后面重新长簇的时候，会重新利用这个接头，所以要恢复3端羟基，此时再用 脱嘌吟嘧啶内切核酸酶，AP-endonuclease ”把带

12、不完整糖基的那个磷酸基切掉 （至此，彻底切掉了 P7的最 后一个尿嘧啶 G），3端羟基就露岀来了（步骤 C）。4）测序边合成边测序，向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（具体见上文）。这些dNTP的3-0H被叠氮基团保护， 因而每次只能添加一个dNTP,这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基。同时在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭

13、荧光信号并去除dNTP 3-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。30x-50x测序深度对于 Hisq系列需要100小时，而对于 2017年初最新推岀的 NovaSeq系列则只需要40个小时!一次测序的数据总产量的单位 Gb，不是计算机字节，而是测序碱基的数目(Giga base)F面是测序量比较(双流动槽为例，如为单流动槽则测序量减少为下表的一半，时间不变)测序仪-次測序的数据总产培| Read(Billion)测序读长(bp)测序时间周期HiSeq 2500720-000 Gba.oPE 1005 daysHiSeq 40001.500 Gb10.0PE 1503,5 daysNova

14、Seq 5000850-1,000 Gb2.8-33PE 1501.7 dsysNovaSeq 60003,000 Gb10.0PE 1501,7 days第三代测序技术单分子测序，以 PacBio公司的SMRT和Oxford Na nopore Tech nologies纳米孔单分子测序技术为主，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行 PCRT增，超长读长，平均达到10Kb-15Kb， 是二代测序技术的 100倍以上。基本原理是：边合成边测序的原则，DNA聚合酶和模板结合，4种碱基(荧光标记dNTP),在碱基配对阶段发岀不同光 ，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。读长主要跟酶的活性

15、 保持有关。OFF TH&1U11SMRT技术的测序速度很快，每秒约 10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎 是目前单分子测序技术的通病） ，达到10%-15%，而且以缺失序列和错位居多。但可通过多次测 序来进行有效的纠错。PacBio SMRT技术除了能够检测普通的碱基之外，还可以通过检测相邻两个碱基之间的测序 时间，来检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。因为假设某个碱基存在表观修饰，则通过聚合酶 时的速度会减慢，那么相邻两峰之间的距离会增大，我们可以通过这个时间上的差异来检测表观甲基化修饰等信息。DMA MetftylSlioriAna ybiiit oi FTilfritru

16、sd KhuMjcsSMRT DMA Sequencinc;七LZOFF TIK &!OFF TIK &!Oxford NanoporeOxford Na nopore的Mi nION是另一个比较受关注的第三代测序仪，俗称|u盘测序仪。是基于电信号而不是光信号的测序技术！OFF TIK &!技术关键是特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基，理论上，它也能直接测序 RNA。附:i *中包祜比ft血酊世,custom电M出敗桂g3

17、1歸込书畤心青电寻:渭H&-100|iL. 1脚1虑峠：性辻轉停H SluftlfltJ!-A1K.韬呂制督畤T強边怕大畫睥利？卄caf.ett t 忻的set吮矜 ii+ .SflT-i -ftiTrtTT，ife淨圻牝丑 區-陛lbAfimi.N%WDd :E二武由童篡*4匕串一十片詞匕百丈n品中辭：阳 时*1比首111时*4弹躺反矗 ?丰*活Qa.?扣IUiniar 1五班四入帝Swilin-TE汩町旳鶴止ZrF習F测卒嚙时吉玮flh甲于證格护 和詁折的;?手属乔AB：用$刊临处傩iM需扌涉比在广为揺湎皿8二代干台册創律搁扫HHt 世盛辯監$Wf仙g阿 曲补醫帯出.A鶴智 18厲塾购冋-

18、Jte：5ir-谭纹7自.4 常事*2S-3JP-也晝，7MiTl?JkJT. A* WTlIt*- IKKi 荃 Li 虫肖曲 if. f.ijJL F啤你鼻-ET泊心知屮執d亍 施u申.就如Im*11 一比，3: Jti*. F 591TJt，副劣牛删绘!$啣了刼地电MJH希曲” rftth 刿扯 制肌夺】旳釣 观 軽诫电1村呻H轴 乩萍上掲 莽當歼射店皿潇昂骨i占*工am松DH.iS檢T析宁结.的般 牛文辺连毎1J0-5=ak=-=itipis-的沆用氏才亍爪e-i -H和1卜 1# Wft 16Wf： 11.? Crt?IW- flFKtJft削无滞业化首前1琳Idti Tmrjeii

19、/i啬找弃益司04购址盹卿.曲八逵1离拖邸储沁刑壯祜的芒.S不需鴉用时诅的禅基Y牛啲可耳RH样和辭! “旳砂算監”IM序rH症:,EifF如,处卡可| RjTr=m-fl.t弋njpu年静无甘觎亦，帀干蛍尸出卡，萱壬斤胡求貯 際B術记航学亍眼1-DFF TMKVU112；主澈测甲机羽的成本潦学比牧InstalmentPurrh”e costAdditional instruments3Service contract1*GxnpuUtional resourcesDaU file sixes (GB 户Primary errorsEnor rate (%r3730x1 (capilhn)$376Desktop003Scibstitubon0.1-1454GSJr TiUnium$108$16$5 (desktop)3 images, klop)20 imarx 4 stiIndd14S4 FLX?$29.5$30$5 (desktop)7) images. 8 s(fIndelrPMBioRS$695$65 cluster20 pulsed, 2 FastqCC deletions16Ion Torrent -