核酸提取纯化常见问题解答

1、核酸提取纯化常见问题解答1. AccuPrep ?凝胶回收试剂盒常见问题2. AccuPrep ?基因组DNA提取试剂盒常见问题3. AccuPrep ? GMO提取试剂盒常见问题4. AccuPrep ? PCR纯化试剂盒常见问题5. AccuPrep ?质粒提取试剂盒常见问题6. AccuPrep ?粪便DNA提取试剂盒常见问题7. AccuPrep ?病毒RNA提取试剂盒常见问题8. 琼脂糖凝胶回收和 PCR纯化常见问题9. 质粒DNA提取操作常见问题AccuPrep ?凝胶回收试剂盒TopQ1.产量低A1. 1）凝胶不完全溶化会导致 DNA产量的降低。离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全

2、，DNA被包裹不能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA的亲和力，最终导致 DNA产量降低。2）加入等量的无水乙醇到 W缓冲液中了吗？过浓的W缓冲液会将DNA洗脱，从而导致产量的降低。3）错误的洗脱缓冲液会降低产量.洗脱缓冲也不能包含过多的盐.缓冲液的pH应调至7.0-8.5。4） 错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂，当颜色为黄色时表示pH在正常范围内。如果颜色为红色或橘黄色，表示 pH已经超出了正常的范围。这时应该加入几滴醋 酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。5） 放入了过多的琼脂糖凝胶块。如果放入了超过 400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸附力，

3、从而导致DNA产量的降低。Q2 琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中A2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB缓冲液。WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮， 这种情况下离心样品三次。如果悬浮的状况依然存在，那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇，再离心一次Q3 提纯后的后续酶反应效率降低A3. 1）样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。这种情况下，加入W缓冲液到结合柱后放置结合柱 5分钟，然后再离心。2）样品中含有残留的 WB缓冲液，残留的乙醇会抑制后续的酶反应，结合柱必须要完全晾干。如 果问题仍然存在，第二次离心后让结合柱晾干 10分钟。3） 一起被洗脱的玻璃纤维影响了酶的活性，再离 心1分钟，转

4、移上清液到一个新的离心管中。AccuPrep ?基因组盒DNA提1tOPQ1. DNA产量或纯度低A1. 1）缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。确保试剂到货后存放于室温（15-25 C），试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH值及稳定性，避免污 染。冻干试剂溶解后应分装并于-20 C保存。2）在洗涤缓冲液1和2中没有加入无水乙醇。加入乙醇后，充分混匀洗涤缓冲液 W1和W2，并且作标记，表明乙醇己加入。3）试剂和样本没有充分混匀。每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。4） 您可能没有选用适合的试剂来洗脱DNA。洗脱DNA需要碱性条件，使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液进行洗脱。5）裂解可

5、能不完全。确保裂解液从混浊变的澄清，表明蛋白质已经降解。根据组织类型不同需要的裂解时间会有差 异。裂解通常需要1-3小时，为保证其效率，可以使用振荡水浴的方法（如实验操作中所述）。 样品中加入蛋白酶K后要立即混匀。裂解液加入结合柱前将样品与异丙醇充分混匀。6）从组织中提取的产量低。在进行消化与裂解步骤之前确保组织破碎为小块（或粉末状），以下两步增加了与蛋白酶K一起 孵育的时间：A将组织与蛋白酶K孵育过夜。B.将组织与蛋白酶K孵育34小时，然后加入新鲜的蛋白酶K 30止再孵育1 2小时。7）产物在260nm 处的吸光值（A260）太高 结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。这些纤维可以将光

6、散射，造成了较高的吸光值 读数。在最后的洗脱阶段，太多的离心也可能导致将结合柱中的玻璃纤维洗脱下来，除去玻璃纤 维的方法如下面所述。Q2.提取的DNA不能够被酶切或酶切完全A2.结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。这些纤维会抑制酶切反应。最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心1分钟，可以在管底看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸岀原来管中的玻璃 纤维即可。Q3 .组织样本中的 DNA降解A3.获得的组织样本应立即-20 冷冻保存，直至开始裂解步骤。使用研钵和研棒在液氮作用下将组织研磨成 粉末，在没有裂解的组织中可能有核酸酶活性。Q4 血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色A4.结合柱可

7、能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 h洗脱液与200（LGC缓冲液混合，再加入100 hl异丙醇，重复纯化步骤。Q5 在某些缓冲液中有白色沉淀（TL或GC缓冲液）A5.经过在低温下的长期存放，组织裂解缓冲液或结合缓冲液中可能出现白色沉淀。在60C孵育可使沉淀溶解。沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。?AccuPrepGMO提取试剂盒TopQ1. DNA产量或纯度低A1. 1）试剂盒保存条件不适当。到货后存于15-25 Co2）缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。确保试剂到货后存放于室温（1525 ）,试剂使用后瓶盖要拧紧，

8、保持其 pH值及稳定性，避免污 染。冻干试剂溶解后应分装并于 28 C或-15-25 C保存。3）使用前在洗涤缓冲液中没有加入无水乙醇。加入乙醇后充分混匀并存于1525 C。做标记标明是否已加入。4）试剂和样本没有充分混匀。每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。Q2. DNA 洗脱回收率低A2.可能使用了不适当的洗脱缓冲液。不要用水洗脱，请用试剂盒中提供的洗脱缓冲液洗脱。Q3. 提取的 DNA 不能够被酶切或酶切完全A3. 结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。这些纤维会抑制酶切反应。最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心1分钟，可以在管低看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管

9、中的玻璃 纤维即可。Q4.产物在260nm 处的吸光值（A260）太高A4. 结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值读数。除 去玻璃纤维的方法如上所述。Q5. DNA 产量低A5. 1） 蛋白酶 K 溶解不完全。按照下面步骤完全溶解蛋白酶 K:1. 吸取 2.5ml 双蒸水加入蛋白酶 K 冻干粉小瓶中。2. 盖上瓶盖，颠倒几次使蛋白酶 K 完全溶解。3分装并做标记，存于 -5 to -25 Co注意：按照此种方法溶解的蛋白酶K至少可稳定存放12个月。2）裂解不完全。加入蛋白酶 K后立即将样本混匀。裂解液加入结合柱前要与异丙醇彻底混匀。Q6. 从组织

10、中提取产量低A6.蛋白酶K消化不完全。确保消化与裂解步骤之前组织破碎成小块。有两种方法增加孵育时间：.组织与蛋白酶K 一起孵育过夜,或孵育蛋白酶K 34小时，再加入30 I蛋白酶K温育12小时。Q7.组织样本中的DNA降解A7.在没有裂解的组织中存在核酸酶活性。组织在进行裂解步骤前应该冻存于-20 C,样品进行匀质化时使用小块组织（20-40 mg）。Q8.血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色A8.结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 4洗脱液与400 4结合缓冲液混合，再加入100 4异丙醇，重复纯化步骤。Q9.在PL缓冲液和B缓冲液中有白色沉淀A9.经过在低温下的长

11、期存放，PL缓冲液或B缓冲液中可能出现白色沉淀。在70C孵育可使沉淀溶解沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。AccuPrep盒PCR化试1TOPQ1.低产量A1. 1.您是否将PCR产物与结合缓冲液充分混匀？不足浓度的离液盐不会增加DNA与结合柱的吸附。2. 您是否在洗涤缓冲液中加入了足量的无水乙醇？浓缩的洗涤缓冲液可以洗去结合的DNA。3. 使用不正确的洗脱缓冲液可能会降低产量。洗脱缓冲液不能含有太多盐离子，最适pH值应为7.0-8.5Q2.样品在琼脂糖凝胶中上样后漂浮A2 .样品可能包含残留的洗涤缓冲液因而导致漂浮。必须离心确保柱子中没有挂壁的液滴。如果这

12、种情况 持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min，然后再进行洗脱。Q3.后续酶切反应不正常A3. 1 .样品中高浓度的盐离子会抑制酶切反应，这种情况下，应在结合柱中加入洗涤缓冲液后静置5 min.再离心2样品中包含残留的洗涤缓冲液，残留的乙醇影响酶切反应的进行，结合柱必须完全干燥。如果这种情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min，然后再进行洗脱。3. 玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，离心1min将上清转移至一个新管即可。AccuPrep ?质粒提取试剂盒1T0PQ1.质粒产量低A1. 1 .您是否收集了足够数量的细胞？产量依赖于宿主菌型，细胞过量

13、也可能会使产量降低.请参阅附录。2. 您是否使用了重悬缓冲液充分悬浮细胞？不完全重悬浮细胞会降低裂解效率。3. 中和缓冲液中是否有盐沉淀？涡旋振荡重新使沉淀溶解。离液盐浓度不适当会导致产量的降低。如果沉淀不易溶解，可于 60 C加热。4加入RNase A干粉后试剂是否保存超过了 6个月？低浓度的RNase A可以导致质粒产量低，6个月后，再加入一些 RNase A，至多达到100 0血Q2.染色体DNA污染（电泳分析时岀现了杂带 ）A2.在第三步，样品不能够涡旋和剧烈振荡，裂解时间不能超过5分钟，这些都可能切断染色体DNA，轻柔处理裂解液。Q3.进行琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮A3.样品含有残

14、留乙醇导致了漂浮，离心后必须使柱子完全干燥，确保结合柱内无挂壁液滴。Q4.序列分析时有许多背景条带A4.您是否检查了宿主 E. coli菌株的内切酶活性？HB101, JM 系列及正常野生型宿主有很高内 切酶活性，通过降解质粒干扰测序反应。对于这些类型，需要第七步变性过程。Q5.样品中含有RNAA5. 1.收集细胞的量过多。我们推荐使用适当的量，根据附录中显示的宿主细胞光密度。2. RNase活性减弱。RNase A干粉加入到重悬缓冲液中保存超过6个月以上，RNase活性会减弱,需再加入一些 RNase A 干粉，多至100 回 丄。Q6.玻璃纤维的洗脱A6.玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了

15、酶的活性，以最大速度离心1min，上清转移至一个新管即可。AccuPrep ?粪便DNA提取试剂盒1TOPQ1.提取后DNA纯度过低A1. 1 试剂盒的储存条件不正确。？试剂盒到货后需要15-25 C保存.2. 缓冲液和其他试剂暴露在影响其活性的环境下。？所有缓冲液均应保存于15-25 。试剂瓶使用后均要盖好盖子以保护其pH值和稳定性，避免污染。任何冻干的试剂被稀释使用后都要储存在2-8 C 或-15- -25 C。3. 洗涤缓冲液（W Buffer）中没加乙醇。 ？ W Buffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。加入后混合好，并储存于15 - 25 C .做好标记以便区分是否已加入乙醇。4

16、. 样品和试剂没有完全混合。？每一步加完试剂到样品中后，都要充分混匀。Q2.洗脱后，DNA的回收率低A2.可能没有用适合的洗脱缓冲液去洗脱DNA.洗脱液需要用碱性的缓冲液。a下次实验时不要用水洗脱DNA，用试剂盒中的洗脱缓冲液洗脱DNAQ3.提取的DNA用限制性酶切不完全或完全不能进行酶切A3.玻璃纤维可能会同 DNA 一起被从柱子中洗脱，它会影响内切酶的活性，最后的洗脱步骤完成后，离心机调到最大速度离心一分钟.玻璃纤维可能在管底被观测到。将上清液转移到一个新的管中，注意不要带走管底的玻璃纤维。Q4.用分光光度计定量时 A260值过高A4.玻璃纤维可能同DNA 一起从柱子中洗脱下来，它也有吸光

17、作用导致A26o值过高？除去玻璃纤维的方法同上述方法一样。Q5. DNA产量过低A5. a.蛋白酶K没有被完全溶解。按如下的操作步骤完全溶解蛋白酶K:1) .取1.25ml的双蒸水到盛有蛋白酶 K的管中。2) .盖上管盖，颠倒几次直到蛋白酶 K完全溶解。3) .分装后储存于 -5 to -25 C .*注意：用这种方法储存得当，蛋白酶 K的活性可以保存1年以上。 b可能裂解不完全。？加入蛋白酶K后立即将样品混合好。 在样品加入结合柱之前，一直搅拌将异丙醇和裂解产物混合好。Q6. SL缓冲液或ST缓冲液中出现白色沉淀A6.在长时间的低温下保存 SL缓冲液或ST缓冲液，其中会出现白色沉淀。 ？任何

18、在SL缓冲液或ST 缓冲液中出现的白色沉淀， 都必须在70。C下加热溶解.沉淀并不影响缓冲液的功能，高温溶解沉淀也不会 增加提取核酸的产量。AccuPrep ?病毒RNA提取试剂盒1TOPQ1.提取后的RNA纯度低A1. 1 试剂盒的保存温度不正确，试剂盒需要15-25 C保存。2. 加入Poly(A)到VB缓冲液后混合完全。3. 洗涤缓冲液(W Buffer )中没加乙醇，W Buffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。混合好后储存于1525 C。做好标记以便区分。4. 样品和试剂没有混合完全，每一步试剂加到样品中后，都要充分混合Q2.洗脱后，RNA的回收率低A2.可能没有用适合的洗脱缓冲液

19、去洗脱RNA.洗脱液需要用碱性的 PH缓冲液.0下次实验时不要用水洗脱，请使用用试剂盒中的洗脱缓冲液进行洗脱。琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题仃0PQ1.产量低A1. 1）溶解不完全使产量降低。不足浓度的离液盐影响DNA与硅基质表面的结合。2）您是否在W缓冲液中加入了足量的乙醇？浓缩的W缓冲液可能会洗去结合的 DNA。3）使用不适当的洗脱缓冲液可能降低产量。洗脱缓冲液不应包含太多的盐。缓冲液pH值应调至7.0-8.5。4）不适当的结合条件如高 pH值会降低产量。SB缓冲液包含pH指示剂，颜色为黄色。超出 pH范围 后颜色变为红色或橙色。这种情况下可加入醋酸钠调整pH值至适当范围。5）切割的胶块太大，多于 400