化学概论课程论文

1、化学概论课程论文禽流感的起源与发展、预防与治疗郑文聪201230220229指导教师 周琢强 副教授学院名称资源环境学院 专业名称1制药工程论文提交日期2013年6月 24 日 论文答辩日期年 月 日 II 键入文字键入文字键入文字 摘要20世纪90年代以前，禽流感就已经在全世界范围内大规模的爆发。禽流感严重威胁着世界各国的养禽业及人类健康。由于禽流感病毒抗原及其致病的易变性以及近年的流行新特点,要求未来的防制措施要采取早日检测,包括用先进的分子生物学诊断技术进行病毒鉴定、检疫,加强疫苗免疫预防等,建立全国性禽流感检测、防控网络,有效防控高致病力禽流感。关键词: 高致病力禽流感 ; 易变性 ;

2、 流行病学 ; 诊断 ; 防治 目录摘要. I1禽流感流行的基本状况 1.1禽流感的危害. 1 1.2 世界各国高致病力禽流感的流行概况. 1 1.3 中国禽流感的流行状况. 2 2 禽流感的流行病学特征2.1 易感禽类增多.32.2 迁栖水禽传播病原的可能性增大.3 2.3 水禽成为重要的传染源和AIV储存库. .32.4 AIV的传播途径.4 2.5 AIV已经突破种间障碍,直接感染哺乳动物.4 2.6 高致病力AIV正在获得对人类的感染能力,是对人类公共卫生的重大威胁因素.4 3 禽流感的结构与作用机理3.1 禽流感病毒的基本特征.5 3.2 AIV的结构组成及功能.6 3.3禽流感病毒

3、致病性相关基因及其分子机制 .8 3.3.1血凝素(Hemagglutinin, HA ).8 3.3.2神经氨酸酶( Neuraminidase, NA ) . 93.3.3非结构蛋白(Non-structural Protein, NS ) . 103.3.4基质蛋白(Matrix Proteins, M ) .11 3.3.5核蛋白(Nucleoprotein, NP)及聚合酶(Polymerase) . 12 3.4 禽流感病毒宿主特异的分子基础 .123.4.1宿主受体. .133.4.2 HA蛋白.133.4.3宿主受体对HA受体特异性的选择.143.4.4其他分子机制.144 禽

4、流感的预防与治疗4.1研制中的流感疫苗. 154.1.1 核酸疫苗.16 4.1.2 减毒活疫苗 .174.1.3 重组载体疫苗. 184.1.4 抗原表位疫苗. .18 4.2 禽流感的主要诊断方法.19结语.206 参考文献.20 1 禽流感流行的基本状况1.1禽流感的危害禽流感性感冒(Avianlnfluenza,AI)简称禽流感,是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。几乎所有的家禽和野禽均易感。禽类感染后表现为高致病力禽流感病毒(HPAIV)引起的急性高度致死性疾病和低致病力禽流感病毒(LPAIV)引起的轻度上呼吸道症状、产蛋下降等系列综合症。历史上高致病力禽流感的每次大爆发都给世界养

5、禽业造成了毁灭性的破坏。禽流感被国际兽医局(OIE)定为A类传染病,并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。世界范围内流行的高致病力禽流感病毒均属于H5或H7亚型,病症的特点是高发病率、高死亡率,病程短促,甚或导致感染鸡群的全群覆灭。同时也不时出现低致病力H5、H7、H9亚型禽流感病毒的广泛流行,对养禽业造成了巨大的威胁1.2 世界各国高致病力禽流感的流行概况20世纪90年代以前,爆发9次禽流感;1959年以来,全世界已爆发高致病性禽流感39次,90年代后又爆发30次,特别是2004年亚洲各国禽流感的爆发更是引起世界的关注,高致病性禽流感发生频率加快,次数增多,范围扩大,不断侵袭着整个世界养

6、禽业。上世纪90年代初之前报道的高致病力禽流感的大爆发有8次,分别是1959年苏格兰的H5NI,1967年英国的H7N3,1975年澳大利亚的H7N7,1979年英国的H5N2,1983年冰岛的H5N8, 1983年美国的H5N2, 1985年美国的H7N7,1991年冰岛的H5N1。进入90年代以后,国外高致病力禽流感的爆发频频发生,从1991年10月起,公开报道发生高致病力禽流感的国家有澳大利亚(H7N3和H7N7),巴基斯坦的(H7N3),墨西哥的(H5N2),意大利的(H7N1),荷兰的(H7N7) 2003,越南(H5N1) 2004,泰国(H5N1)2004,比利时(H7N7)20

7、03,德国(H7N7)2003,韩国(H5N1)2003,美(H7N?)2004。韩国(H5N1)2004,日本(H5N1)2004,印度尼西亚(H5N1)2004,柬埔塞(H5N1)2004,老挝(H5N1)2004,巴基斯坦(H7N? H9)2004,美国(H7N? H7N2)2004,加拿大(H7N?)2004。1976年以来3,澳大利亚发生了4次高致病力禽流感,前2次由H7N7引起,后两次由H7N3引起。1994年巴基斯坦爆发的高致病力禽流感有220万只禽受到感染,群体平均发病率为13.9%86%,发病群体死亡率51%100%。1994年5月,墨西哥从3个州的雏鸡中分离出低致病的H5N

8、2亚型病毒,1995年初爆发了H5N2亚性高致病力禽流感,临诊特征和剖检有高致病力禽流感的特征,其病原是由最初的H5N2亚型低致病性禽流感突变而来。1999年,意大利爆发了H7N1亚型高致病力禽流感,销毁了1 400万只家禽,补偿农户6 300万美元,损失6.2亿美元。2003年荷兰禽流感波及比利时和德国。在荷兰,全国1/4(3 000万只)的家禽被销毁;比利时销毁了270万只家禽,德国销毁了40万只家禽。除了关注已导致禽流感大规模爆发流行的H5、H7亚型病毒外,还应密切关注其他亚型具有高致病力特征的禽流感病毒引发禽流感大爆发的可能。如1979年在英国的火鸡中和1993年在新加坡的鸭中分离到H

9、10禽流感病毒株,其静脉致病指数(IVPI)分别为1.56和1.62,完全符合高致病力的特征。1998年在中国分离到的H3N8毒株,其IVIP为1.44,属高致病力禽流感毒株。1.3 中国禽流感的流行状况我国的禽流感发生比较晚,发病情况远较欧美等地区为轻,我国最早报告禽流感的是徐为燕(1980)在南京鸡鸭加工厂的外观健康的鸭群中,随机采了86只鸭泄殖腔棉拭子进行了检查,有15例分离出A型流感病毒。1992年陈伯伦等4在广东省某地鸡群中分离出H9亚型的禽流感病毒,陈福勇等(1997)从某鸡厂分离出H9N2AIV5。唐秀英等6(1996)从发病鸡群中分离到2株H4N6及3株H9N2病毒;从鹅体内分

10、离到3株H5N1病毒,并首次从发病鸡群中分离到一株H14N5禽流感病毒。经权威部门致病性测定,3株H5N1鹅体内分离毒株为高致力毒株,其余分离株为低致病力毒株。1997年4月,香港流浮山3个鸡场的4 800只鸡突然死亡,检验结果为H5N1禽流感病毒感染;1997年5月21日1名3岁男童死于雷耶氏综合症及肺炎合并症,并从气管分泌物中分离出一株H5N1禽流感病毒,毒株命名为A/hongkong/156/97(H5N1)。11月、12月分别发现第2例、第3例、第4例H5N1亚型禽流感病毒感染者,截止1998年2月11日有18人被确诊为H5N1亚型禽流感病毒感染发病,其中6人死亡,12人康复或正在康复

11、,1人视为可疑。这次禽流感的发生被称为/香港禽流感事件。在这次事件中,约有150万只鸡、鸭和鹅等被补杀,直接耗资6 000万港元,用于对养禽业的补贴达10亿港元。这次禽流感给人类造成的灾害及对家禽业造成的损失虽无法与前几次禽流感大爆发相比,但却开创了禽流感直接感染人并致人死亡的先例。2004年1月27日我国广西自治区隆安县宣布发生高致病性禽流感,至2004年2月19日在不到一个月的时间内,我国有16个省市自治区,超过40个县、市(区)报告发生了高致病性禽流感,经国家农业部哈尔宾兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定,为H5N1AIV。(至2004年3月16日,所有49起疫情的疫区全部解除封锁)。这

12、次禽流感的爆发共报告发病禽只143 084只,捕杀9 016 316只,免疫鸡只14 015 884只,所造成的经济损失尚未完全统计。2 禽流感的流行病学特征2.1 易感禽类增多 从禽流感的流行资料分析得知7,8,禽流感病毒可存在于许多家禽及野生禽类,如火鸡、鸡、珍珠鸡、石鸡、鹌鹑、鹅和鸭;野鸡、野鹅、三趾鹬、赤翻鹬鸡、燕鸥、天鹅、鹱、鹭、海鸥、海鹦和鸥。从八哥、长尾小鹦鹉、鹦鹉、白鹦,编织鸟、麻雀和鹰等笼养鸟中也可分离到病毒。2.2 迁栖水禽传播病原的可能性增大有人发现,迁栖水禽(如:迁栖鸭)产生的病毒比其他禽类多7。1966年,明尼苏达洲发生高致病性AI,给当地养殖业造成了严重损失。该地火

13、鸡群在每年711月份发病率最高,此时正是野鸟经过该洲南迁及大量火鸡在牧场上饲养8。Sle-mons等在俄亥俄州对当地水禽及迁徙经过该州的水禽进行了为期3年的调查,发现秋季迁徙鸟中AI感染率平均为5.9% ,19861988年共从水禽中分离出55株AIV,分别属于23个HA亚型8。Otsuki等,在日本377只天鹅、284只针尾鸭等鸟的899份粪便样品中分离到5株AIV,其亚型为H3N6、H9N2、H11N3、H13N6。这些鸟类可在中国北部和西伯利亚地区与日本之间迁徙2004年春12月份发生在我国华南和东南亚多国的H5N1高致病性禽流感,我国多数专家认为与迁徙鸟有关,因为从西伯利亚到我国华南、

14、东南沿海有三条迁徙鸟飞行路线。2.3 水禽成为重要的传染源和AIV储存库有研究认为,A型AIV复杂的生态系统存在于禽类,尤其是水禽8。1952年由wakker等从加拿大商品鸭中分离到AIV以来,迄今世界上许多国家的专家已从家鸭、野鸭和鹅中分离到近30个血清亚型AIV,但是大多数水禽AIV分离株对鸭、鹅和鸡无致病力或致病力较低,过去的教科书和资料记载普遍认为水禽仅是AIV的携带者,排毒而不发病。然而20世纪90年代中期(1996,1999)以来,水禽感染PHAIV发病和死亡的事实打破了人们对水禽流感的传统认识)水禽不仅可以自然发病和死亡,而且是AIV的巨大储存库,可横向传染陆生禽类而成为发生流感

15、的传染来源。有人研究认为水禽的AIV可以在北方冬季寒冷的池塘和湖中越冬,并在第二年再感染飞到该地生活的鸟类。2004年初我国第一起AI疫情就发生于广西隆安县一个养鸭场。2.4 AIV的传播途径不少研究认为AI的传染源为受感染的病禽7,AI感染病禽可以从呼吸道,结膜或粪便中排出病毒,传播途径主要为感染禽与易感禽群的直接接触,或由病禽呼出的气溶胶或与暴露于病毒污染物(如:鸟类和哺乳动物,饲料,水源,设备,笼具,运输车辆和昆虫等)的间接接触。垂直传播的证据很少8。但有证据表明,实验感染鸡的蛋中有AIV的存在。以H5N2毒株所作人工感染试验表明,在感染后34 d内母鸡产的蛋中几乎都含有病毒。因此,不能

16、完全排除垂直传播的可能性,污染鸡群产的蛋也不能作孵化用。有人发现水禽的AIV可以传染给陆生禽,水禽生活的水域中可分离到病毒,并可传染给猪,因此认为过去宣传的猪、鸡、鸭(鹅)立体养殖或混养易造成AIV的传播。2.5 AIV已经突破种间障碍,直接感染哺乳动物1999年以来,邓国华9陆续从广东,广西等省分离到一些H5N1亚型AIV,对这些分离株的生物学特性进行了详细的研究,发现这些分离株对鸡已表现为高致病力,但不具备感染哺乳动物的能力。但是2002年研究我国部分的AIV分离株获得对小鼠这一动物模型的高度感染性。他们发现16株病毒中的3株能够突破小鼠的血脑屏障,可在感染后第3天造成全身感染。因此说明,

17、我国AIV在长期的进化过程中,逐渐获得了对哺乳动物的感染能力。2004年12月我国华南地区和东南亚部分国家HPAI的爆发也证明了这一点,于康震等10指出,从猪体内分离到H9N2AIV,泰国的3只家猫感染了H5N2AIV,2004年2月12日泰国一只老虎感染H5N1AIV死亡11。2.6 高致病力AIV正在获得对人类的感染能力,是对人类公共卫生的重大威胁因素 自从人类认识禽流感的一百多年里,人们的基本认识是,AIV是不感染人的。但1997年中国香港禽流感事件中致18人感染6人死亡的事例拉开了禽流感病毒直接感染人的序幕,人们不得不重新认识HPAIV的公共卫生意义。2003年2月香港又确诊H5N1引

18、起发病和致人死亡的病例。2003年4月荷兰H7N7亚型HIV引起了83人感染,导致1名兽医死亡; 2004年1 2月越南、泰国H5N1HPAIV感染人和引起人死亡。付朝阳,邢大昌等3认为,禽流感被认为是人流感病毒发生变异的最大新基因库,禽流感的爆发和流行,将增加禽流感病毒与人流感病毒发生基因重排的机会,增加新流感病毒产生的机率,对人类的健康构成潜在的威胁。他们经过对A/HK/156/97病毒株8个片段的序列分析,并分别与人源和禽源流感病毒进行比较,发现该病毒8个基因片段同源率最高(90.1%98.5%)的毒株均为禽流感病毒,未发现任何曾经在中间宿主中与人流感病毒发生基因重排的证据,因此确定该病

19、毒来源于禽类。我国大陆虽未发现AIV感染人的病例,但必须承认AIV在免疫选择压力下发生变异的可能性,必须高度关注已经开始或正在感染人的高致病力禽流感病毒亚型的演化动态。3禽流感的结构与作用机理3.1 禽流感病毒的基本特征禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)属于正粘病毒科(Orthomy Xoviridae)流感病毒属,属A型禽流感病毒。流感病毒内部的核心由单链核糖核酸及核蛋白组成,根据核蛋白(NP)与基质蛋白(MS)的抗原性不同可分为A、B、C三型禽流感病毒。病毒粒子一般为球形,也有杆状或长丝状的。病毒粒子核心外有一层脂质囊膜,从囊膜伸出的棒状纤突称血凝素(Hema

20、gglutinin,HA),蘑菇状纤突称神经氨酸酶(Neuraminidase,NA),HA和NA均具有抗原性,根据H与N的不同可区分为不同亚型。血凝素可和红细胞表面的糖蛋白受体结合而发生凝集现象,具有亚型和株的特异性。神经氨酸酶是具有催化活性的四聚体,能将唾液酸从糖蛋白和糖脂中切开,其重要功能是能将吸附在细胞表面的病毒粒子解脱下来。目前已经发现禽流感病毒有16种HA和9种NA,根据HA和NA的不同将禽流感病毒分为许多亚型,目前世界上已分离到上千种AI病毒毒株,分属100多个亚型,各亚型之间缺少交叉保护作用。引起HPAI的毒株大部分是H5或H7亚型,而大多数的H5与H7分离株的毒力又是很低的。

21、AIV的抗原性可不断的发生变异,常见的变异形式是抗原的漂移(drift)和抗原的转移(shift)。抗原的漂移是由编码HA或NA蛋白的基因发生点突变引起的,其中HA基因的变异率高。抗原的转移是HA和NA主要抗原的变化,由于突变幅度较大,导致新的亚型产生。实验证明,不同亚型的病毒同时感染一个细胞时,病毒基因组可发生节段的交换。AIV的基因组有8个RNA片段,从理论上推断,如果同一个细胞同时感染两种或以上的AIV,有可能产生256种新的重组病毒。这是容易产生HPAIV毒株的基础。大量的研究表明,AIV的致病力与HA糖蛋白切割位点上的一组碱性氨基酸有关。HPAIV的这组氨基酸的序列的最小单位为B-X

22、-B-R,其中B为碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸,X为非碱性氨基酸,R为精氨酸。病毒与细胞膜的融合需要HA上的切割位点容易受到蛋白酶的切割,而后方可产生融合,从而使病毒基因组穿入细胞浆完成一次感染过程。细胞内识别和切割HA糖蛋白的特异蛋白酶在体内不同细胞内的活力决定了病毒在体内的分布。由于H5和H7亚型HPAIV的HA切割位点上存在一系列的碱性氨基酸,细胞内的类枯草杆菌碱性蛋白酶使得这种切割更容易产生。由于宿主的大多数细胞都有这种蛋白酶,所以HA的切割在宿主细胞内发生。由于几乎所有细胞都能产生切割HPAIV上HA的蛋白酶,故HPAIV再感染下一个细胞时不再需要外源蛋白酶的帮助即可产生感染,这就是HP

23、AIV引起严重病症和高死亡率的原因。而非HPAIV在HA切割位点上仅有单一碱性氨基酸(精氨酸),它只能被类胰蛋白酶所识别,而这种蛋白酶只存在于呼吸道和肠道细胞,所以非HPAIV的复制仅限于这些特定部位,所引发的病症也是有限的。3.2 AIV的结构组成及功能AlV的基因组由8个片段组成，按序列大小依次为PB2, PB1 , PA, HA,NP, NA, M和NS，共编码11种病毒蛋白11,12 ; A型AIV粒子在电镜下多呈球形，直径为80-120 nm，部分呈多面形或丝状13 o A由囊膜和核衣壳组成14囊膜来自宿主细胞的脂膜，包括内膜蛋白、类脂和糖蛋白3层;糖蛋白形成2种纤图，一种是由HA分

24、子的三聚体构成的棒状纤图，另一种是由NA分子的四聚体构成的蘑菇状纤图15。在病毒囊膜上镶嵌有以四聚体形式存在的基质蛋白2C matrix protein 2, M2;基质蛋白1 ( matrix protein 1, Ml)在囊膜内壁上形成一层包裹在病毒核心外的膜结构，维持病毒形态16, 17。核衣壳由RNA、核蛋白及3种多聚酶组成，呈对称的超螺旋结构。AIV每个片段的两端都有一段保守序列，5末端和3末端的保守序列反向互补形成锅柄环状的二级结构，从而形成病毒RNA聚合酶结合所必需的核普酸识别位点ls，具体结构见图1.1 图1.1禽流感病毒结构模式图AIV粒子由(o. 8-1.1 %的1ZNA,

25、 (5w8)%的碳水化合物、(20w24)%的脂质和(70w 75)%的蛋白质组成;碳水化合物主要包括核糖半乳糖、甘露糖、墨角藻糖和氨基葡糖，在病毒粒子中以糖蛋白或糖脂的形式存在;脂质位于病毒的囊膜内，大部分为磷脂，少量为胆固醇糖脂19, 20。由于流感病毒具有多形性，因此不同毒株的化学组成也有一定的差异。 A1V每个基因片断的5末端和3末端均有高度保守序列，5末端保守序列为13个核普酸:5 GGA ACA AAG AUG Appps , 3末端保守序列为12个核普酸:3 Ho-UCG UUU UCG UCC X210 22;它们分别编码1 w-2种蛋白质，共编码11种蛋白:PB2, PBI,

26、 PB1-F2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1和NS2,具体功能见表1.2表1.2禽流感病毒基因组及其编码蛋白的功能3.3禽流感病毒致病性相关基因及其分子机制 AIV侵入宿主机体后引起疾病的严重程度即致病性或表现的病毒毒力是病毒与宿主之间相互作用的结果。一方面取决于病毒本身相关的毒力因子，这些因子主要有HA, NA, PB2, M2, NS 1蛋白;另一方面与宿主本身及其抗病毒状态密切相关，二者相辅相成，共同决定了AIV的致病力。3.3.1血凝素(Hemagglutinin, HA ) HA蛋白是由片段4编码的，约1742-1778 nt，编码562-566个氨基酸，

27、是构成AIV囊膜纤突的主要蛋白之一，是最重要的保护性抗原，能诱导机体产生亚型特异抗体，在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用。HA是病毒毒力主要决定因素，而HA前体(HAO )能否有效地被水解为HA 1和HA2两个亚单位是决定病毒感染性的先决条件(Chen et al., 1998)，故而HAO对蛋白酶切割的敏感性与AIV的毒力呈正相关。如果HA易于被切割，毒株有较高的毒力，反之，则毒力较低。HA前体的裂解的难易程度，主要与HA裂解位点的氨基酸的性质及排列顺序、裂解位点附近的糖链及感染宿主等密切相关(陈宣烁等，2006;黄淑坚等，2004;曹梅等，2004)。 HA裂解位点的氨基酸的性质、数目及排列

28、是影响其有效裂解的主要因素。对禽HS和H7亚型高致病性毒株的HA蛋白的氨基酸序列分析表明，高致病力毒株的HA的裂解位点至少由4个碱性氨基酸残基组成，其序列为R-E-R-R-R-K-K-R,该序列可被分布于宿主全身的多种细胞蛋白酶(如在禽类体内广泛存在的PC6丝氨酸蛋白酶)识别，决定了HPAW在禽体内的广泛嗜细胞性，引起宿主各系统的变化;而低致病力毒株的HA裂解位点含有1-2个碱性氨基酸，其序列呈R-X-X-R/K(X为非碱性氨基酸残基)，这些毒株只能被一些细胞(主要局限于呼吸道粘膜、消化道粘膜)的蛋白水解酶识别和切割，从而使病毒只能局限在消化道或呼吸道粘膜上皮细胞中增殖，引起局部(呼吸道或消化

29、道)感染(Wood et al., 1993; Vey et al.,1992)。另外，裂解序列的氨基酸可通过插入、缺失或重组等方式，实现LPA IV向HPA IV的转换。Perdue等(1989)研究发现，1995年春墨西哥暴发的HPA I是由1993年底L PA 1V的HA切割位点的氨基酸发生替换造成的。这一点也可通过反向遗传技术得到印证(Horimoto et al., 1994; Subbarao et al., 2003 )。3.3.2神经氨酸酶( Neuraminidase, NA ) NA是由片段6编码的含453个氨基酸残基的多肤，是位于AN囊膜表面的另一种纤突蛋白，属于II型糖

30、蛋白，即氨基端在囊膜内而梭基端在囊膜外。NA的一级结构包括氨基端胞浆尾、非极性跨膜区、柄部和头部序列，这些结构各自具有不同的功能(Gong et al., 2007;李向忠等，2005)。NA具有亚型特异性，能诱导机体产生特异性抗体，该抗体及其抑制剂能抑制AIV的复制(Gubareva et al., 2000 )。 NA具有重要的生物学功能。NA具有酶活性，能催化裂解宿主细胞表面的唾液酸残基，利于子代病毒从宿主细胞表面的释放，防止病毒聚集，促进病毒穿过覆盖在呼吸道上皮细胞的瓤液而扩散(Goto et al., 1998 )。另外NA还能能使病毒移动到正确的位点与HA受体结合，提高病毒感染宿主

31、细胞的效率(Suzuki et al.,2005; Ohuchi et al., 2006 )。最近的研究，推测NA还能加速机体内IgA的清除，破坏勃膜IgA的生成和介导巨噬细胞对感染流感病毒受体的吞噬作用(McCullers etal., 2003; Watanabe et al., 2004 )，但这些还需进一步研究。 NA柄部的长度与AIV的致病力密切相关。NA的柄部使其头部远离病毒囊膜，利于NA活性的发挥，若柄部较短，NA的活性中心太靠近病毒囊膜，使底物不能进入，不利于子代病毒释放(李向忠，2005)。研究表明，柄部氨基酸非常不保守，不同亚型和同亚型毒株的差异较大，在62-82间变化，

32、因此，柄部的长短会影响AIV的致病力。通过反向遗传技术研究表明，在柄部插入氨基酸后可使NA的活性降低20%;当NA柄长在0-52个氨基酸变化时，病毒在组织培养的复制能力无变化，然而在鸡胚中，柄部越长，病毒复制越好，NA无茎，则病毒只局限在呼吸器官复制(Castrucci et al., 1993 )。研究表明，NA柄部长度还可平衡HA的功能(Baigentet al., 2001)。 除了NA的柄部外，其他区域也同样影响病毒毒力。NA的胞内区虽然不是病毒复制所必须的，但其可影响病毒粒子的组装和出芽，改变粒子形状，影响NA蛋白的表达量和稳定性，从而影响病毒的毒力。跨膜区通过影响NA蛋白的输出而影

33、响病毒粒子的出芽和释放。而头部是活性中心，任何一个氨基酸的突变都会影响到NA的活性。总之，NA也是影响AIV毒力的关键因子之一。 NA柄部长度对适合培养病毒的组织范围起决定性作用。Luo等研究发现，缺失NA柄部的病毒在组织培养中具有活力，但在鸡胚接种或滴鼻感染小鼠试验中没有活力，故而推测，一定长度的NA柄部是其在鸡胚中进行有效复制是必须的。3.3.3非结构蛋白(Non-structural Protein, NS ) AIV片段8编码NS 1和NS2蛋白，NS 1和NS2大量存在于感染的细胞内，NS 1主要在核内，NS2主要在胞浆内。研究发现，NS 1蛋白是A型流感病毒唯一的非结构蛋白，是一个

34、具有多种活性的调控因子。NS 1蛋白仅存在于病毒感染的细胞内，且在感染的早期，大量存在于细胞核中，而在感染的晚期，NS 1蛋白也可出现于细胞浆中，且能刺激机体产生抗NS1蛋白的抗体(Krug et al., 2003 )。N52又称为核运输蛋白(Nuclear export protein, NEP )主要在晚期大量合成，它能与M1蛋白相互作用促进RNP在胞核和胞浆之间的运输(ONeill et al., 1998; Neumann et al., 2000;Lommer et al., 2002; Iwatsuki et al., 2004)。 NS 1蛋白是一种多功能调节蛋白，在调节流感病

35、毒的致病性及毒力方面发挥着重要的作用。如果说HA和NA是在AIV感染过程中调节其毒力，而NS 1蛋白是在细胞水平上调节AIV毒力，决定了AIV对宿主细胞破坏能力。NS 1蛋白从宿主和病毒两个方面来调节病毒的致病性和毒力。在宿主方面，NS 1蛋白可通过抑制宿主细胞蛋白的合成、诱导细胞凋亡以及拮抗干扰素的产生等方式调节机体的抗病毒反应，间接地发挥其增强病毒致病性的功能;另一方面，NS 1蛋白可通过增强病毒mRNA的翻译来提高病毒的复制，直接增强AIV抵抗宿主的抗病毒反应的能力。 NS 1蛋白通过其RNA结合域和效应区及个别位点氨基酸的突变或缺失来发挥其重要功能。3.3.4基质蛋白(Matrix P

36、roteins, M ) AIV片段7可编码基质蛋白M1和M2M1是病毒颗粒中含量最丰富的蛋白质，是病毒的主要结构蛋白，具有型的特异性，其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一。X一射线晶体结构表明，M1蛋白能结合病毒RNA和囊膜，具有稳定病毒形态，并对核衣壳的形成具有重要作用(Sha et al., 1997 )。研究表明，M1蛋白能调节病毒转录酶的活性，还与核糖核蛋白复合体(RNP)相互作用控制转录，从而在病毒感染过程中可发挥一连贯的调节作用，包括调节核糖核蛋白输出、抑制病毒基因转录以及其在病毒出芽过程中所起的关键作用。研究证实了M1蛋白可与宿主细胞膜上的蛋白激酶c受体发生相互作用，催化了M

37、1蛋白的磷酸化，进而在病毒复制及感染中起作用。 M2蛋白只存在于A型流感病毒中，是一种非糖基化的蛋白，由AIV片段7转录的第2个小mRNA翻译。该蛋白以四聚体形式，形成一个质子通道，来调控高尔基体内的pH及酸化病毒粒子内环境(Czabotar et al., 2004;朱建国等，2004;郑丽舒等，2006;万春和等，2007)。 M2蛋白具有独特的调控病毒毒力的机制。 M2蛋白作为一种离子泵，能降低并维持细胞内含体的pH值。当病毒颗粒被细胞摄取而进入内涵体时，M2蛋白的离子通道活性增强，使离子进入病毒颗粒内，导致pH降低。这样就使得血凝素( HA)-M 1间的连接键被破坏，病毒颗粒打开，使H

38、A环区卷曲螺旋，其分子内的融合肤移位，使病毒和内涵体膜相互靠近并最终发生融合。当pH降到一定程度时，M2蛋白发挥活性，终止pH下降，并使HA融合肤段暴露，这样可使HA与内涵体膜融合，并将RNP释放到胞质中，同时酸性内涵体中的H+利用M2离子通道进入病毒颗粒内部，导致不同的病毒蛋白发生解离;M1蛋白的聚集作用被破坏，RNP从M1蛋白复合体上解离，并释放到细胞质中，并通过转运到细胞核中，病毒RNA以ATP依赖的形式进入细胞核进行转录和翻译(Duong et al., 2005; Kass etal., 2005; Wu et al., 2005)。3.3.5核蛋白(Nucleoprotein, N

39、P)及聚合酶(Polymerase) NP由AIV片段5编码，是病毒粒子的主要结构蛋白，具有种群和型特异性。研究表明，NP与病毒的RNA及多聚酶共同装配成RNP复合体(Marion et al.,1997)，通过NP与RNA、其它病毒蛋白成分(Avalos et al., 1997)及感染细胞上某些大分子之间的相互作用，影响病毒的转录、复制、装配及转运功能，而病毒的复制与转录直接关系到对宿主的侵害，是病毒感染与致病的重要因素(Sidhartha et al.,1998)。进一步研究发现，在病毒的RNA合成过程中，NP对病毒从转录模式转换成复制模式具有重要的作用，体内和体外病毒感染试验均证明，缺

40、乏可溶性的NP蛋白，病毒不能从转录向复制模式转换(Biswas et al., 1998 )。因此推测，NP蛋白可通过这种模式的转换来实现其对病毒致病性的调控。 AIV的聚合酶由PB2, PB1和PA组成，其中PB2能识别来自宿主细胞mRNA的带帽子结构(7mGpppGpNm)的引物，发动RNA的转录，并在转录过程中切除mRNAS，端帽子结构。研究发现，PB2的627位氨基酸的种类与AIV的致病力相关。若627位为谷氨酸(Glu)，则致病力弱，若为赖氨酸(L ys)则致病力强。因此，在HA裂解序列相同的前提下，PB2的627位单个氨基酸的变化(Glu-Lys)可以使HSN 1 A IV对小鼠的

41、毒力从弱到很强地变化(Hatta et al:, 2001)。近年来，发现了AIV的第11种功能蛋白，称为PB 1-F2蛋白，该蛋白是由PB 1+ 1阅读框编码的87个氨基酸残基，也称为絮肤(Junk peptides)，大量存在于细胞线粒体中。PB 1-F2能诱导细胞凋亡，推测是由于PB 1-F2损害细胞内部的线粒体，杀死免疫细胞(单核细胞)，从而使机体无法对流感感染作出反应并抵抗病毒攻击。PB 1-F2的发现给流感病毒感染及不同亚型在不同宿主表现的毒力差异提供又一种解释方式或研究思路(Chen et al., 2001)。3.4禽流感病毒宿主特异的分子基础 在自然界中，AIV不仅感染禽类，

42、还感染哺乳动物，甚至通过中间宿主(猪)或直接感染人类，但这种感染能力具有局限性，要经过变异而获得对特定宿主的感染力，这说明了AIV具有宿主特异性。这种宿主特异性由病毒和宿主两方面共同决定的。3.4.1宿主受体 AIV感染细胞的第一关是HA蛋白受体识别并与宿主细胞受体结合，使病毒吸附在细胞表面，并在受体介导下进入细胞内繁殖和复制，因此，宿主受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的决定因素之一。研究发现，AN的受体是宿主细胞表面糖蛋白的糖链末端的唾液酸残基。唾液酸主要以2-3或2-6糖昔键连接于糖链末端的半乳糖基上，不同种属的动物体，其连接键型也不同。研究发现，禽类胃肠道上皮细胞表面含有唾液酸a 2,

43、3半乳糖的唾液酸寡糖(SAa 2,3Gal );人呼吸道上皮细胞表面主要含有唾液酸a 2,6半乳糖的唾液酸寡糖(SAa 2 ,6Gal );海豹、鲸肺组织上皮细胞表面存在SAa 2,3Gal;猪呼吸道上皮细胞表面兼有SAa 2,3Gal和SAa2,6Gal(蒋露芳等，2005)。进一步研究发现，多数AN优先结合于SAa 2,3Gal;人流感病毒则优先结合于SAa 2, 6Gal;海豹、鲸流感病毒优先识别SAa 2,3Gal;猪流感病毒对SAa2,3Gal和SAa2,6Gal均能结合。这些说明了唾液酸一半乳糖基连接键型是决定流感病毒识别受体能力的关键因素之一。3.4.2 HA蛋白 HA蛋白能与宿

44、主细胞受体特异性结合，是决定宿主特异性的关键因素。病毒的受体结合部位位于头部，HA 1在此区折叠而形成小的凹陷，呈浅口袋状，正适合装入宿主细胞受体即糖链末端的唾液酸分子。研究发现，HA蛋白受体结合位点及其附近氨基酸的变异决定其对宿主细胞表面唾液酸SAa 2,3Gal和SAa 2,6Gal的受体结合特异性。人与禽流感病毒受体的差异与HA蛋白第226位氨基酸密切相关，若第226位氨基酸残基为Gln，则具有SAa2,3Gal受体结合特异性，若为Leu则具有SAa2,6Gal受体结合特异性，如果第226位氨基酸残基为Met，则同时对SAa2,3Ga1和SAa2,6Ga1均具有相同的结合能力。研究发现，

45、毒株A/Hongkong/156/97 (HSN 1) HA第226位氨基酸为Met，可能是导致该毒株感染人的另一个重要原因。Suzuki等(2001)发现，HA蛋白第226、228位氨基酸对受体结合特异性很重要，如果仅有第226位氨基酸由Leu置换为Gln，则优先识别NeuAca2,3Ga1，而对NeuGca 2,3Ga1识别力低;如果第226位氨基酸由Leu置换为Gln，同时第228位氨基酸Ser置换为Gly，则对NeuAca 2,3Ga1和NeuGca2,3Ga1识别能力相近。Vines等(1998)也发现，HA蛋白226位Ixu-Gln及228位Ser-Gly，可使人的H3亚型流感病毒

46、感染鸭，并能在鸭肠道繁殖，同时改变其血凝活性。因此，第226位或228位氨基酸的变异可能是流感病毒在不同宿主间传播的一个重要机制。另外，HA受体连接位点周围的碳水化合物残基可以调节HA与唾液酸间的亲和性(Matrosovich et al., 2000 )。3.4.3宿主受体对HA受体特异性的选择 研究发现，所有经MDCK细胞培养的人流感病毒表现出严格的受体结合特异性，即与SAa2,6Ga1受体强亲和力结合，与SAa2,3Ga1受体结合很弱;所有经鸡胚培养的人类流感病毒对SAa2,3Ga1受体的亲和力增加(Gambaryan et al., 1997;1999)。禽流感病毒在猪体内的连续复制，

47、其受体特异性向SAa2,6Ga1转变，这可能导致AIV获得与人细胞表面受体有效结合的能力，从而可不需基因重组就能感染人。因此，AIV具有获得有效结合人细胞表面受体的潜力，这一点值得重视。3.4.4其他分子机制 NA茎部的长度也是决定AIV宿主特异性的因素之一。Matrosovich等(1999)通过对GenBank中不同禽类毒株HA和NA序列比较，发现NA茎区氨基酸缺失与HA额外的糖基化位点是H5, H7亚型禽流感一个重要特征，并且可能是AIV从水禽适应到陆禽过程中所必须。Banks等(2001)在对1999年意大利H7N 1亚型HPA IV研究中也发现，NA蛋白茎区的第54-75位缺失了22

48、个氨基酸残基，这可能是导致流感病毒由野水鸭H7N1亚型毒株适应于鸡的原因所在。另外，NA亚型在哺乳动物中存在一定的分布规律，如人、猪流感病毒多为N1, N2，马流感病毒多为N7, N8，这说明NA对AIV感染宿主也有一定的影响(Horimoto et al., 2001) Scholtissek等认为，NP磷酸化能增强流感病毒的增殖能力，而这种磷酸化是由宿主细胞来完成的，不同的宿主磷酸化能力不同，从而影响了流感病毒感染宿主的范围。 Subb等(1993)研究发现，若PB2第627位氨基酸由Glu替换成切s，则AIV获得了在哺乳动物细胞(如MDCK)增殖能力。同时也发现，所有AIV的627位氨基

49、酸均为Glu，而所有人流感病毒此位点的氨基酸均为Lys o Amonsin等(2006) 对6例虎一禽流感病毒进行序列分析发现，PB2蛋白的第627位均被置换为Lys,可能是AIV对宿主选择而发生的特异性改变。因而，PB2第627位氨基酸在决定流感病毒的宿主范围中起着重要作用。另外，AIV的其它基因产物(PB1, PA, M 1,M2, NS1, NS2)在决定宿主特异性方面也可能起作用。许多动物的血清中存在着与HA受体竞争的竞争抑制剂，这也是影响宿主特异性的另一个重要的因素。4禽流感的预防与治疗4.1研制中的流感疫苗同其他的病毒性疾病一样，流感的防治尚无特别有效的方法。当今，接种流感疫苗仍然被认为是预防流感发生与传播的最佳方法。而接种疫苗的个体，要看个体本身