细胞分离与胞内产物溶解3h

1、细胞分离与胞内产物溶解3h1 第二章第二章 细胞破碎与分离细胞破碎与分离 细胞分离与胞内产物溶解3h2 生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程 本章内容 细胞分离与胞内产物溶解3h3 概概 述述 细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是指利用外力破）技术是指利用外力破 坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产 物成分释放出来的技术。物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分 泌型生化物质（产品）的基础。泌型生化物质（产品）的基础。 为了研究细胞破碎，提高其

2、破碎率，有必要为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要 了解各种生物细胞壁的组成和结构。了解各种生物细胞壁的组成和结构。 细胞分离与胞内产物溶解3h4 1. 1.细胞壁结构对破碎的影响细胞壁结构对破碎的影响 Z微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。细胞膜。 Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。细胞壁。 Z不同细胞壁的结构和组成不

3、完全相同，故细胞不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。不同。 细胞分离与胞内产物溶解3h5 (1)(1)细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构 Z 几乎所有细菌的细胞壁都是几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链；的聚糖链； Z 相邻聚糖链上的短肽又交叉相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；网状结构，包围在细胞周围； Z 使细胞具有一定的形状和强使细胞具有一定的形状和强 度。度。 细胞分离与胞内产物溶解3h

4、6 细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构 u破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存 在的肽键的数量和其交联的程度。在的肽键的数量和其交联的程度。 u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很 大不同。大不同。 u革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种 细胞生产了很多细胞重组的产物。细胞生产了很多细胞重组的产物。 药物名称药物名称宿主宿主用途用途 胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿

5、病治疗糖尿病 人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病 - -干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等 细胞分离与胞内产物溶解3h7 (2)酵母细胞壁的结构酵母细胞壁的结构 u最里层是由葡聚糖的细纤维最里层是由葡聚糖的细纤维 组成，它构成了细胞壁的刚组成，它构成了细胞壁的刚 性骨架，使细胞具有一定的性骨架，使细胞具有一定的 形状，形状， u上面的是一层糖蛋白，上面的是一层糖蛋白， u最外层是甘露聚糖，由最外层是甘露聚糖，由1,6-1,6- 磷酸二酯键连接成网状。在磷酸二酯键连接成网状。在 该层的内部，有甘露聚糖该层的内部，有甘露聚糖- - 酶的复合物

6、。酶的复合物。 u破碎酵母细胞壁的阻力主要破碎酵母细胞壁的阻力主要 决定于壁结构交联的紧密程决定于壁结构交联的紧密程 度和它的厚度。度和它的厚度。 细胞分离与胞内产物溶解3h8 (3)(3)真菌的细胞壁真菌的细胞壁 l真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次 还含有较少量的蛋白质和脂类。还含有较少量的蛋白质和脂类。 l不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同， 其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚 糖构成，少数含纤维素。糖构成，少数含纤维素。 l与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的与

7、酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的 强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此， 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。以强度有所提高。 细胞分离与胞内产物溶解3h9 l例如：红面包霉菌细胞壁具有同例如：红面包霉菌细胞壁具有同 心圆层状结构主要存在三种聚合心圆层状结构主要存在三种聚合 物物 l最外层最外层(a)(a)是是-和和-葡聚糖的葡聚糖的 混合物，混合物， l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构 l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质， l最内层最内层(d)

8、(d)主要是几丁质。主要是几丁质。 红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图 细胞分离与胞内产物溶解3h10 微生物细胞壁的组成和结构比较微生物细胞壁的组成和结构比较 微微 生生 物物 革兰氏革兰氏 阳性细菌阳性细菌 革兰氏革兰氏 阴性细菌阴性细菌 酵母菌酵母菌真菌真菌 壁壁 厚厚 20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-100- 250nm250nm 层层 次次 单层单层多层多层多层多层多层多层 主主 要要 组组 成成 肽聚糖肽聚糖(40-(40- 90%)90%) 多糖多糖 胞壁酸胞壁酸 蛋白质蛋白质 脂多

9、糖脂多糖(1-4%)(1-4%) 肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%) 脂蛋白脂蛋白 脂多糖脂多糖(11-(11- 22%)22%) 磷脂磷脂 蛋白质蛋白质 葡聚糖葡聚糖(30-(30- 40%)40%) 甘露聚糖甘露聚糖 (30%)(30%) 蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%) 脂类脂类(8.5-(8.5- 13.5%)13.5%) 多聚糖多聚糖 (80-90%)(80-90%) 脂类脂类 蛋白质蛋白质 细胞分离与胞内产物溶解3h11 （4 4）植物细胞壁的结构）植物细胞壁的结构 l对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生 壁两部分。壁

10、两部分。 l初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1 1 3m3m），富有弹性。），富有弹性。 l由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半 纤维素和果胶类物质。纤维素是长链纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-D-葡聚糖，许葡聚糖，许 多这样的长链形成微纤丝。多这样的长链形成微纤丝。 l它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来 自于微纤丝。自于微纤丝。 细胞分离与胞内产物溶解3h12 植物次生细胞壁植物次生细胞壁 某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生

11、某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生 细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚 (4m(4m以上以上) )，常有三层组成。，常有三层组成。 n在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增 加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则， 而且存在木质素的沉积。而且存在木质素的沉积。 因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性， 使植物细胞具有很高的机械强度。使植物细胞具有很高的机械强度。 细胞分离与胞内产物溶解3h13 3.2 3.2

12、 细胞破碎技术细胞破碎技术 细胞分离与胞内产物溶解3h14 机械破碎机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 物理破碎物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 化学破碎化学破碎 有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 酶促破碎酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外通过细胞本

13、身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎而达到细胞破碎 细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理 细胞分离与胞内产物溶解3h15 一机械法 机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization） 高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding） 超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication） 细胞分离与胞内产物溶解3h16 采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组

14、成）。采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。 1.高压匀浆法高压匀浆法 （High-pressure homogenization） 细胞悬浮液自高压室针细胞悬浮液自高压室针 形阀喷出时，每秒速度形阀喷出时，每秒速度 高达几百米，高速喷出高达几百米，高速喷出 的浆液又射到静止的撞的浆液又射到静止的撞 击环上，被迫改变方向击环上，被迫改变方向 从出口管流出。细胞在从出口管流出。细胞在 这一系列高速运动过程这一系列高速运动过程 中经历了高速剪切、碰中经历了高速剪切、碰 撞及压力骤降，造成细撞及压力骤降，造成细 胞破碎。胞破碎。 细胞分离与胞内产物溶解3h17 细胞分离与胞内产物溶解3h18 高压

15、匀浆器的种类高压匀浆器的种类 高压匀浆器的种类较多：高压匀浆器的种类较多： pWABWAB公司的公司的AVP Gaulin 31MRAVP Gaulin 31MR型型 pBran and luebbe Bran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型 p意大利意大利Niro SoaviNiro Soavi 高压匀浆机高压匀浆机 细胞分离与胞内产物溶解3h19 高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆法使用时注意事项 u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约- -/10MPa/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度

16、，使出口温度调节在温度，使出口温度调节在2020左右。左右。 u可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。式。 u在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。多次循环的操作方法。 细胞分离与胞内产物溶解3h20 高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围 大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法 高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞

17、浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。 不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。 易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀 浆阀）浆阀） 细胞分离与胞内产物溶解3h21 影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素 被破碎的细胞分率符合如下公式：被破碎的细胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNPln1/(1-R)=KNP (15-1) (15-1) 式中式中 R R 破碎率，为破碎率，为NN次循环后，蛋白次

18、循环后，蛋白 质的释放量质的释放量RnRn与最大释放量与最大释放量RmRm之比；之比； K K 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数； P P 操作压力，操作压力，MPaMPa； 与微生物种类有关的常数。与微生物种类有关的常数。 细胞分离与胞内产物溶解3h22 l升高压力有利于破碎，升高压力有利于破碎， 减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几 乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p

19、 p 超生一定值时，超生一定值时，R R增加但很慢。增加但很慢。 在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。 l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同 大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎， 生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基 上容易破碎。上容易破碎。 影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素 细胞分离与胞内产物溶解3h23 2 珠磨法 bead mill u珠磨是常用的方法 u细胞悬浮液与

20、极细的玻璃小细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨珠、石英砂、氧化铝等研磨 剂（直径小于剂（直径小于1mm1mm）一起快速）一起快速 搅拌或研磨，研磨剂、珠子搅拌或研磨，研磨剂、珠子 与细胞之间的互相剪切、碰与细胞之间的互相剪切、碰 撞，使细胞破碎，释放出内撞，使细胞破碎，释放出内 含物。含物。 u在工业规模的破碎中，常采在工业规模的破碎中，常采 用高速珠磨机用高速珠磨机 WSK卧式高效全能珠磨机 细胞分离与胞内产物溶解3h24 高速珠磨机工作原理 l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器 高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；

21、高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动； l细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起 l在出口处，旋转园盘和出口平在出口处，旋转园盘和出口平 板之间的狭缝很小，可阻挡玻板之间的狭缝很小，可阻挡玻 离小珠，使不被料液带出。离小珠，使不被料液带出。 l由于操作过程中会产生热量，由于操作过程中会产生热量， 故磨室还装有冷却夹套，以冷故磨室还装有冷却夹套，以冷 却细胞悬浮液和玻离小珠。却细胞悬浮液和玻离小珠。 细胞分离与胞内产物溶解3h25 Netzsch LM-20型珠磨机 A-具有冷却夹套的圆筒形磨室 B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘 C-环形震动侠

22、缝分离器 D-变速马达 1和2料液进出口 3和4 搅拌冷却剂进出口 5和6磨室冷却剂进出口 l园盘以两种位置交错地安装在轴上， l一种处于径向，一种与轴倾斜， l径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。 l由于交错的运动，提高了破碎效率。 细胞分离与胞内产物溶解3h26 珠磨机破碎作用方程 u破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程， 符合下列公式：符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2 ln1/(1-R)=Kt 15-2 uR R 破碎率；破碎率；K K一一 一级反应速度常数；一级反应速度常数；t t一一 时间。时间。 uK K与搅拌转

23、速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠 装量和珠体直径，以及温度等相关。装量和珠体直径，以及温度等相关。 珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%80%以下：降低能耗、减少大分以下：降低能耗、减少大分 子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不 易分离而给后续操作带来的困难。易分离而给后续操作带来的困难。 细胞分离与胞内产物溶解3h27 3 超声波破碎 l超声波破碎法（超声波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声波利用超声波 振荡器

24、发射的振荡器发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞的超声波探头处理细胞 悬浮液。悬浮液。 l超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。声波的声频、声能有关。 细胞分离与胞内产物溶解3h28 超声波破碎的机理 JY92-II D超声波超声波 细胞粉碎机细胞粉碎机 (一般认为在超声波作用下液体发生空化作用一般认为在超声波作用下液体发生空化作用 （cavita

25、tion),cavitation), (液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大 的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞 上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从 而使细胞破碎。而使细胞破碎。 (操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或 外部冷却的容器中进行。外部冷却的容器中进行。 细胞分离与胞内产物溶解3h29 超声波破碎的适用范围 超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。微生

26、物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破细菌易破 碎，对酵母菌的效果较差。碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质失活。活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大， 但但。 细胞分离与胞内产物溶解3h30 技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例 匀浆法匀浆法 (孔型孔型) 须使细胞通过的小须使细胞通过的小 孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪 切力而破碎切

27、力而破碎 剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模 处理处理 珠磨破碎珠磨破碎 法法 细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁 珠捣碎珠捣碎 剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物 细胞的大规模处理细胞的大规模处理 超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作 用使细胞破碎用使细胞破碎 适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模 处理处理 研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜 匀浆法匀浆法 (片型片型) 细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细 胞胞 不同机械破碎方法的比较 细胞分离与胞内产物溶解3h

28、31 二二 非机械法非机械法 非机械方法很多 1 酶解 2 化学法溶胞 3 物理法 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 其中酶法和化学法溶胞应用最广。 细胞分离与胞内产物溶解3h32 1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis) 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细 胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破 坏细胞膜。 （1）外加酶法 常用的溶酶常用的溶酶 溶菌酶、溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、 蛋白酶、蛋白酶、 甘露糖酶、甘露糖酶、 糖苷酶、糖苷酶、 肽键内切酶、肽键内切酶、 壳多糖酶等壳多糖酶等 细胞分离与胞内产物溶解3h33 外加酶法 2

29、2）酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必）酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必 须根据细胞的结构和化学组成来选择。须根据细胞的结构和化学组成来选择。 3 3）溶菌酶（）溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖能专一性地分解细胞壁上肽聚糖 分子的分子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁 的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快 就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用 溶菌酶无效果，必须与螯合剂溶菌酶无效

30、果，必须与螯合剂EDTAEDTA一起使用。一起使用。 4 4）放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖）放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖 为主要成分，所以也能采用溶菌酶，为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 5 5）酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、）酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、 几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 6 6）植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和）植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和 半纤维素酶裂解。半纤维素酶裂解。 细胞分离与胞内产物溶解3h34 外加酶法 有

31、时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加 入时需确定相应的次序。入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作 用蛋白质用蛋白质- -甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入 葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生 质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。裂，释出胞内产物。 细胞分离与胞内产物溶解3h35 （2）酶解法的特点 优点： u发生酶解的条件温和 u能选择

32、性地释放产物 u胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整 缺点：缺点： 溶酶价格高，溶酶价格高， 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) ) 产物抑制的存在。产物抑制的存在。 细胞分离与胞内产物溶解3h36 （3）酶解自溶作用 l 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自 身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能 水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续 下去。下

33、去。 l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓自溶作用：改变其生长环境（温度、缓 冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产 生其它的自溶酶，以达到自溶目的。生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细 胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 细胞分离与胞内产物溶解3h37 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、 抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透 性（

34、渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 2 化学渗透法化学渗透法（Chemical permeation） 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁的结构与组成。 细胞分离与胞内产物溶解3h38 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常 采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分 从细胞内渗漏出来。 成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。 （1）酸、碱处理法）酸、碱处理法 细胞分离与胞内产物溶解3h39 细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂： 十二烷

35、基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。 非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏 内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 （2 2）表面活性剂）表面活性剂 无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型， 都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用， 能与细胞壁上的脂

36、蛋白结合，形成微泡，使膜的通能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通 透性增加或溶解透性增加或溶解 细胞分离与胞内产物溶解3h40 能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物 质被释放出来。质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3 3）有机溶剂）有机溶剂 （4 4）EDTAEDTA螯合剂螯合剂 处理处理G-G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。 G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子CaCa2+ 2+或 或MgMg2

37、+ 2+结合脂多糖 结合脂多糖 和蛋白质来维持，一旦和蛋白质来维持，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+ 2+或 或MgMg2+ 2+螯合，大量的脂多糖 螯合，大量的脂多糖 分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。 细胞分离与胞内产物溶解3h41 u通用性差；通用性差； u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%； u有些化学试剂有毒。有些化学试剂有毒。 u化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度并影响最终产物纯度 化学渗透法特点：化学渗透法特

38、点： 缺点缺点 l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子 量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等 大分子量的物质仍滞留在胞内；大分子量的物质仍滞留在胞内； l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液 分离和进一步提取。分离和进一步提取。 优点优点 细胞分离与胞内产物溶解3h42 3 3 物理法物理法 u渗透压冲击法渗透压冲击法 u冻结冻结-融化法融化法 u干燥法干燥法 细胞分离与胞内产物溶解3h43 1）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法， n

39、将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外 渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀 释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然 变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而 破裂。破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理 或在培养过程中加入某些

40、抑制剂（如抗生素等），使或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使 细胞壁有缺陷，强度减弱。细胞壁有缺陷，强度减弱。 细胞分离与胞内产物溶解3h44 2）冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在室温中），然后在室温中 融化，反复多次而达到破壁作用。融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞 的亲水性能，的亲水性能， 另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而 破裂。破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复

41、多适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多 次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 细胞分离与胞内产物溶解3h45 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽 提出来。提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质

42、冷冻干燥适用于不稳定的生化物质 3 3）干燥法）干燥法 气流干燥气流干燥 真空干燥真空干燥 喷雾干燥喷雾干燥 冷冻干燥冷冻干燥 细胞分离与胞内产物溶解3h46 细胞分离与胞内产物溶解3h47 5.选择破碎方法的依据：选择破碎方法的依据： u细胞处理量；细胞处理量； u细胞壁强度和结构细胞壁强度和结构( (高聚物交联程度、种高聚物交联程度、种 类和壁厚度类和壁厚度) )； u目标产物对破碎条件的敏感性；目标产物对破碎条件的敏感性； u破碎程度；破碎程度； u目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放 细胞分离与胞内产物溶解3h48 （1）选择性释放目标产物的一般原则 仅破坏或破碎存在目标产物的位置

43、周围 l当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的 方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。 当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机 械破碎法械破碎法 l当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时， 调节溶液调节溶液PHPH值，离子强度或添加与目标产物具有亲值，离子强度或添加与目标产物具有亲 和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产 物容易溶解释放。物容易溶解释

44、放。 机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和， 在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的 破碎程度。 细胞分离与胞内产物溶解3h49 青霉素酰化酶细胞破碎的研究青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一一. 化学法化学法 20%(W/V)大肠杆菌悬浮液大肠杆菌悬浮液 + B.A 37搅拌搅拌 高高 速离心速离心 测上清液酶活。测上清液酶活。 1.处理时间处理时间 R% 2. 丁酯用量丁酯用量 条件：条件：37 ，搅拌，搅拌3小时小时 适宜的加量为适宜的加量为12% ， 释放率释放率R=55% 12% 55% R 12% 2.03U/mg 比 活 细胞分离与胞内产物溶解3h50 二二. 化学法化学法冻融

45、法结合冻融法结合 加加B.A(12%,37B.A(12%,37搅拌搅拌3h3h） 菌悬液菌悬液 冻融冻融( (冻结冻结14h 14h 融化融化) ) 释放率释放率70%70%；比活；比活2.69 u/mg2.69 u/mg 三三. 化学化学超声波振荡法结合超声波振荡法结合 先丁酯处理，再超声波（先丁酯处理，再超声波（9090秒），释放率秒），释放率72%72% 小型设备，不能工业大规模生产。小型设备，不能工业大规模生产。 四四. 高压匀浆法高压匀浆法 20%(W/V)20%(W/V)菌悬液，菌悬液，P=50MPaP=50MPa，N=3N=3。释放率。释放率R=38.4%R=38.4%， 原因原

46、因: :细胞破碎后细胞破碎后, ,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。仍有较多酶吸附在细胞碎片上。 五五. 高压匀浆高压匀浆化学法结合化学法结合 先高压匀浆，再加先高压匀浆，再加10%10%丁酯，丁酯，3737搅拌搅拌3h3h，高速离心，高速离心(3(3万万rpm)rpm)， 释放率：释放率：R=60%R=60% 六六. 珠磨珠磨 直径玻璃珠。直径玻璃珠。释放率：释放率：R=95%R=95% 细胞分离与胞内产物溶解3h51 （2 2）破碎率的测定）破碎率的测定 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相， 使导电率上升。使导电率上升。 直接测定法直接测定法

47、目的产物测定法目的产物测定法 导电率测定法导电率测定法 采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫 色，而受损害的细胞呈亮红色。色，而受损害的细胞呈亮红色。 将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量 或活性，并与或活性，并与100%100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。破碎率的标准值比较，计算其破

48、碎率。 细胞分离与胞内产物溶解3h52 6. 6. 破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向 多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。 酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合 如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa95MPa压压 力下匀浆力下匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀。而单独采用高压匀 浆法，同样条件下破碎率只有浆法，同样条件下破碎率只有32%32%。 有机溶剂与冻融法、干燥法结合有机溶

49、剂与冻融法、干燥法结合 细胞分离与胞内产物溶解3h53 破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向 - -（2 2）与上游过程相结合）与上游过程相结合 v在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pHpH、 温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁 膜的结构与组成有一定的影响。膜的结构与组成有一定的影响。 v在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑 制剂制剂( (如青霉素如青霉素) )，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其，继续培养一

50、段时间后，新分裂的细胞其 细胞壁有缺陷，利于破碎；细胞壁有缺陷，利于破碎； v选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； v用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌 体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活 噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。 细胞分离与胞内产物溶解3h54 破碎技术研究方向破碎技术研究方向-与下游工程相结合与下游工程相结合 举例：萃取破碎法提取

51、酵母醇脱氢酶举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶 细胞分离与胞内产物溶解3h55 Z 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。 目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生 物活性。物活性。 Z 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常 代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。 Z 高表达产生的积聚物在细胞内部形成

52、不溶物原因？高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀； 蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀； 蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； 表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/ /诱导组分不足，不能形成溶解状态诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定。蛋白质自身不稳定。 3.3 基因工程包含体的纯化基因工程包含体的纯化 细胞分离与胞内产物溶解3h56 外源蛋白在大肠杆菌中的积累 蛋白蛋白 产

53、物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白 外源蛋白的积累外源蛋白的积累 人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体 - -丙酰胺酶丙酰胺酶 20%20%在细胞间区在细胞间区 - -人体干扰素人体干扰素25%25% 形成包涵体形成包涵体 凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体 牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体 - -内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体 人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体 细胞分离与胞内产物溶解3h57 （ inclusion bodies IBs) 1. 基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理 (

54、胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心, ,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。 (胞内表达：胞内表达： l胞内可溶性表达胞内可溶性表达：离心：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心， 收集上清收集上清纯化纯化 l胞内周质表达胞内周质表达：离心：离心, ,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透 压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心, ,收集上清液收集上清液纯化。纯化。 l不溶性包涵体不溶性包涵体：离心：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离心, ,收集收集 沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。 细胞分离

55、与胞内产物溶解3h58 3 基因工程包涵体的纯化方法基因工程包涵体的纯化方法 收集菌体细胞 细胞破碎 包涵体包涵体的洗涤 目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性 包含体的出现不仅增加了包含体的出现不仅增加了 生物分离设计的难度，也生物分离设计的难度，也 为蛋白质折叠机理研究提为蛋白质折叠机理研究提 出了新的课题。出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标欲获得天然活性态的目标 产物，必需分离包含体后，产物，必需分离包含体后， 溶解包含体并使其中的目溶解包含体并使其中的目 标蛋白恢复应有的天然活标蛋白恢复应有的天然活 性。性。 细胞分离与胞内产物溶解3h59 4. 包涵体获得 几种常见的工艺路线(一)

56、机械破碎机械破碎 ( (高压匀浆、高速珠磨）高压匀浆、高速珠磨） 离心提取包含体离心提取包含体 加变性剂溶解加变性剂溶解 除变性剂复性除变性剂复性 细胞分离与胞内产物溶解3h60 特点特点: :是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用 离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分 开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复 性。性。 优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒 素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个素等杂质，使后面的分离纯化简单了

57、。从这个 角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点缺点: :要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎 片，加工时间较长。片，加工时间较长。 路线路线1 的特点的特点 细胞分离与胞内产物溶解3h61 包涵体获得 几种常见的工艺路线（二） 机械破碎 膜分离获得包涵体 加变性剂溶解包含体 除变性剂复性除变性剂复性 细胞分离与胞内产物溶解3h62 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔路线（二）应用了膜分离技术，用微孔 膜除去可溶性蛋白质。膜除去可溶性蛋白质。 u优点是封闭式操作，不污染环境也不受优点是封闭式操作，不污染环境

58、也不受 环境污染，能量消耗也比离心法少。环境污染，能量消耗也比离心法少。 u缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住， 难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常 常导致可溶性蛋白质的滞留。常导致可溶性蛋白质的滞留。 路线路线2 的特点的特点 细胞分离与胞内产物溶解3h63 包涵体获得 几种常见的工艺路线（三） 化学破碎 （加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 细胞分离与胞内产物溶解3h64 l用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎 又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，又可以溶解包含体，将两道工序和

59、为一道， 节省了设备和时间，比前两者更适合于实节省了设备和时间，比前两者更适合于实 验室操作。验室操作。 l缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混 杂在产物中间，给后续分离带来困难。杂在产物中间，给后续分离带来困难。 路线三：路线三： 细胞分离与胞内产物溶解3h65 1）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤 l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 l洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外， 还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖 等，复性时会与目标蛋白一起复

60、性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分 子而聚集，给后步纯化带来困难。子而聚集，给后步纯化带来困难。 l洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的 弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除 去部分膜蛋白和脂质类杂质。去部分膜蛋白和脂质类杂质。 l洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达 产物为原则。产物为原则。 细胞分离与胞内产物溶解3h66 2）目标蛋白的变性溶解）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解