胚胎工程实验之体外受精

1、实验二实验二 小鼠卵母细胞的体外受精小鼠卵母细胞的体外受精 v对畜牧业生产、动物生殖机理的研究及保护濒危对畜牧业生产、动物生殖机理的研究及保护濒危 动物、治疗人类的不孕不育症等具有重要意义动物、治疗人类的不孕不育症等具有重要意义 v可望解决胚胎移植所需胚胎的生产成本及来源匿可望解决胚胎移植所需胚胎的生产成本及来源匿 乏等关键问题。乏等关键问题。可利用可利用IVMIVFIVC体外大规体外大规 模生模生 产高质量的胚胎，产高质量的胚胎，建立工厂化生产胚胎的成建立工厂化生产胚胎的成 套技术，以大量生产质优价廉的胚胎，套技术，以大量生产质优价廉的胚胎，大大加速大大加速 品种改良进程。品种改良进程。 体

2、外受精的意义体外受精的意义 v能为动物克隆和转基因等其他胚胎生物技术能为动物克隆和转基因等其他胚胎生物技术 提供丰富的实验材料和必要的研究手段提供丰富的实验材料和必要的研究手段 v充分挖掘优良公母畜的繁殖潜力充分挖掘优良公母畜的繁殖潜力 v评定家畜精子的质量评定家畜精子的质量 1978年年 英国英国 v由于正常受精过程的完成需要一个完全成熟的卵由于正常受精过程的完成需要一个完全成熟的卵 子和一个获得受精能力的精子，且其受精后需对子和一个获得受精能力的精子，且其受精后需对 其进行培养才能发育成为一个可移植的胚胎，因其进行培养才能发育成为一个可移植的胚胎，因 此，从广义上讲，体外受精技术又包含此，

3、从广义上讲，体外受精技术又包含卵母细胞卵母细胞 的体外成熟培养、精子的体外获能、体外受精、的体外成熟培养、精子的体外获能、体外受精、 受精卵的体外培养受精卵的体外培养等多项密切相关的技术。等多项密切相关的技术。 一、实验目的一、实验目的 v熟悉雄鼠的生殖器官的结构特点；熟悉雄鼠的生殖器官的结构特点； v掌握从输卵管上取成熟卵母细胞的方法；掌握从输卵管上取成熟卵母细胞的方法； v掌握从附睾尾部取精子的方法、精子的体外掌握从附睾尾部取精子的方法、精子的体外 获能和体外受精方案、受精率的观察。获能和体外受精方案、受精率的观察。 二、实验器材和材料二、实验器材和材料 v1. 器材及药品器材及药品 v体

4、视显微镜，手术器械，体视显微镜，手术器械，1mL注射器，胶头滴管，注射器，胶头滴管， 口吸管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑 料培养皿，记号笔，血细胞计数板、载玻片、盖玻料培养皿，记号笔，血细胞计数板、载玻片、盖玻 片。片。 v0.1透明质酸酶，卵母细胞操作液（透明质酸酶，卵母细胞操作液（M2），精子），精子 操作液和受精液（操作液和受精液（T6），胚胎培养液（），胚胎培养液（CZB，有糖，有糖 和无糖）、激素（和无糖）、激素（PMSG和和HCG），石蜡油。），石蜡油。 2实验动物实验动物 v3-4周龄昆明系雌性小白鼠和周龄昆明系雌性小白鼠和8-

5、12周龄雄鼠，周龄雄鼠， 自由采食饮水，控光一周以上，暗光时间自由采食饮水，控光一周以上，暗光时间20： 00-6：00；光照时间；光照时间6：00-20：00。 三、实验内容三、实验内容 1体内成熟卵母细胞的获取体内成熟卵母细胞的获取 v超排方法：超排方法：15：00腹腔注射腹腔注射PMSG10 IU/只小鼠。只小鼠。 48小时后腹腔注射小时后腹腔注射hCG10 IU/只。只。 v注射注射hCG 后后14-15h，利用颈椎脱臼法处死小鼠，利用颈椎脱臼法处死小鼠 （方法同实验一），取输卵管于（方法同实验一），取输卵管于M2操作液中，清洗操作液中，清洗 两次，在体视显微镜下用眼科镊子撕开输卵管壶

6、腹两次，在体视显微镜下用眼科镊子撕开输卵管壶腹 部释放出卵丘卵母细胞复合体团，用口吸管吹打几部释放出卵丘卵母细胞复合体团，用口吸管吹打几 次，把次，把COC团分散开。团分散开。 IVM卵母细胞（小鼠）卵母细胞（小鼠） 2体外受精体外受精 v21 取附睾尾部精子取附睾尾部精子 v选取性成熟（选取性成熟（8周）昆明白雄鼠，已通过交配实验周）昆明白雄鼠，已通过交配实验 证明其有受精能力，颈椎脱臼法杀雄鼠，打开腹腔，证明其有受精能力，颈椎脱臼法杀雄鼠，打开腹腔， 将附睾尾部和输精管剪下，剔除脂肪，在实体显微将附睾尾部和输精管剪下，剔除脂肪，在实体显微 镜下，用镊子和针头配合，挤出输精管内精子。针镜下，

7、用镊子和针头配合，挤出输精管内精子。针 头刺破附睾尾部上皮，挤压出精子（图头刺破附睾尾部上皮，挤压出精子（图2-1）。）。 大鼠（公）大鼠（公） 22精子的洗涤精子的洗涤 v在小鼠上可省略（从附睾尾部取精子），但在大动在小鼠上可省略（从附睾尾部取精子），但在大动 物上必需（射出精液），洗涤可除去获能抑制因子、物上必需（射出精液），洗涤可除去获能抑制因子、 卵黄、甘油等。卵黄、甘油等。 23精子的获能精子的获能 v马上收集精子团块，置于马上收集精子团块，置于1.5mL离心管中，离心管中， 加入加入1mL含含10mg/mLBSA的的 T6，轻微振荡，轻微振荡 几次，使精子团分散开，用封口膜封口，于

8、几次，使精子团分散开，用封口膜封口，于 37.5，5CO2，95空气，空气，100 湿度的湿度的 CO2培养箱内中孵育培养箱内中孵育1.5h左右。左右。 发展中的南京农业大学动物胚胎工程技术中心 24精液品质检测精液品质检测 v主要检测活力和密度，方法参考主要检测活力和密度，方法参考动物繁殖动物繁殖 学实验教程学实验教程。 附：精液品质检查附：精液品质检查 v精液品质检查精液品质检查 (semen quality measurement)(semen quality measurement)是为了是为了 鉴别精液质量的优劣。评定的各项指标，既是确定精鉴别精液质量的优劣。评定的各项指标，既是确定

9、精 液取舍、新鲜精液进行稀释保存的依据，又能反映雄液取舍、新鲜精液进行稀释保存的依据，又能反映雄 性动物饲养管理水平和其生殖器官的机能状态。性动物饲养管理水平和其生殖器官的机能状态。 v因此，常用作诊断公畜不育或确定其种用价值的重要因此，常用作诊断公畜不育或确定其种用价值的重要 手段，同时也是衡量精液在稀释、保存和运输过程中手段，同时也是衡量精液在稀释、保存和运输过程中 的品质变化和处理效果的重要判断依据。的品质变化和处理效果的重要判断依据。 指指 标标 v精子活力精子活力 (motility)(motility) v 精子活力是指精液中呈前迸运动的精子所占百分率，也称精子活力是指精液中呈前迸

10、运动的精子所占百分率，也称 活率。由于它与精子的受精能力直接相关，所以是评价精液活率。由于它与精子的受精能力直接相关，所以是评价精液 品质的一个重要指标。通常在采精后，精液处理前、后，冷品质的一个重要指标。通常在采精后，精液处理前、后，冷 冻精液解冻后和输精前进行检查冻精液解冻后和输精前进行检查 v精子密度精子密度 v每每mLmL中精子的数目（细胞计数板）中精子的数目（细胞计数板） v精子顶体异常率精子顶体异常率 (abnormal acrosome (abnormal acrosome rate)rate)： v 精子顶体在受精过程中具有重要作用，精子顶体在受精过程中具有重要作用， 一般认为

11、只有呈前进运动、且顶体完整一般认为只有呈前进运动、且顶体完整 的精子才具有正常受精能力。的精子才具有正常受精能力。 v精子畸形率精子畸形率 (ASR)(ASR)： v凡形态和结构不正常的精子通称为畸形精子。凡形态和结构不正常的精子通称为畸形精子。 在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但 一般不会超一般不会超20%20%。优质精液，精子畸形率不能。优质精液，精子畸形率不能 超过如下数值超过如下数值: :牛牛18%18%，水牛，水牛15%15%，羊，羊14%14%，猪，猪 18%18%，马，马12%12%， 25体外受精体外受精 v将成熟的将成熟的COC移入已

12、经平衡移入已经平衡2h的受精滴中的受精滴中 （T6+20mg/mL），加入适量体积的获能精），加入适量体积的获能精 子，使精子密度在子，使精子密度在1106右，置于培养箱中右，置于培养箱中 孵育孵育8h，观察原核形成和第二极体排出，计，观察原核形成和第二极体排出，计 算受精率。算受精率。 体外受精质量的评定体外受精质量的评定 v体外受精成功的判断指标：体外受精成功的判断指标： v精子穿透率精子穿透率 v原核形成率原核形成率 v卵裂率卵裂率 v囊胚率囊胚率 v通过染色或胚胎培养通过染色或胚胎培养 3胚胎培养胚胎培养 v洗去精子，将胚胎换液于无糖洗去精子，将胚胎换液于无糖CZB继续培养。胚胎继续培

13、养。胚胎 过阻断之后（过阻断之后（4cell）换为含葡萄糖的）换为含葡萄糖的CZB，换液，换液 时间在有时间在有1/3的胚胎到达的胚胎到达4cell后进行，大约在受后进行，大约在受 精后精后36h48h之间。之间。 v在受精后在受精后24h、48h、72h、96h各观察一次，记录各观察一次，记录2 cell、4cell、桑椹胚、囊胚的发育情况。、桑椹胚、囊胚的发育情况。 四、作业四、作业 v1计算本实验的受精率、卵裂率和囊胚发育计算本实验的受精率、卵裂率和囊胚发育 率。率。 鼠号鼠号卵数卵数受精率受精率 卵裂率卵裂率 囊胚率囊胚率 v2简述实验中的注意事项。简述实验中的注意事项。 v3简述体外

14、受精的步骤。简述体外受精的步骤。 哺乳动物正常体内受精哺乳动物正常体内受精 为了提高动物繁殖率，家畜体外受精技术在为了提高动物繁殖率，家畜体外受精技术在20世纪世纪80年代初研究成功，年代初研究成功， 并在近并在近10年得到逐步完善。年得到逐步完善。 体外受精（体外受精（IVF）：指用经特殊处理的精子在体外使卵母细胞受精的）：指用经特殊处理的精子在体外使卵母细胞受精的 技术。技术。经经IVF-ET所生的婴儿称试管婴儿。所生的婴儿称试管婴儿。 精子受精卵 卵子 生殖细胞 的收集 精子 卵母细胞 卵母细胞 体外成熟培养 受精 受精卵的体外培养 精子 体外获能 v发情周期观察超排活体取卵（或发情周期

15、观察超排活体取卵（或 屠宰场卵巢卵母细胞的体外成熟）屠宰场卵巢卵母细胞的体外成熟） v采精精液品质检测精子体外获能采精精液品质检测精子体外获能 v体外受精（或体外受精（或ICSI） 胚胎质量检测胚胎质量检测 胚胎移植妊娠分娩胚胎移植妊娠分娩 技术流程技术流程 卵子的收集和处理卵子的收集和处理 v体内：（超排后从卵巢或输卵管内）体内：（超排后从卵巢或输卵管内） v体外：屠宰场的卵巢体外：屠宰场的卵巢 v本实验用小鼠卵巢本实验用小鼠卵巢 Egg retrieval, detail view 未成熟卵母细胞未成熟卵母细胞 脱去卵丘的未成熟卵母细胞脱去卵丘的未成熟卵母细胞 GVBDGVBD 成熟的卵母

16、细胞成熟的卵母细胞 IVM卵母细胞（小鼠）卵母细胞（小鼠） 放射冠放射冠 透透 明明 带带 卵卵 质质 膜膜 卵母细胞卵母细胞 极体极体 1 3 2 v精子入卵的三道屏障：精子入卵的三道屏障： v 扩展的卵丘扩展的卵丘 v 透明带透明带 v 卵质膜卵质膜 弱精、畸精、少精症弱精、畸精、少精症 患者的精子很难穿越患者的精子很难穿越 三道屏障三道屏障 卵卵 巢巢 v卵巢大多呈卵圆形，都成对存在。卵巢大多呈卵圆形，都成对存在。 v由于各级卵泡及排卵后出现的一系列变化，由于各级卵泡及排卵后出现的一系列变化， 致使牛、猪卵巢表面凹凸不平。致使牛、猪卵巢表面凹凸不平。 v卵巢位置是半游离的，系于卵巢系膜上

17、。卵巢位置是半游离的，系于卵巢系膜上。 v猪：青年猪为椭圆形，较小；多胎次后呈葡猪：青年猪为椭圆形，较小；多胎次后呈葡 萄串状。萄串状。 v卵巢为实质器官，实质为各级卵泡，包括卵巢为实质器官，实质为各级卵泡，包括原始卵泡、原始卵泡、 初级卵泡、生长卵泡和成熟卵泡。初级卵泡、生长卵泡和成熟卵泡。 v原始卵泡数量很多，但能成熟的卵泡很少，绝大部原始卵泡数量很多，但能成熟的卵泡很少，绝大部 分退化成为闭锁卵泡。分退化成为闭锁卵泡。 v成熟卵泡排出卵细胞后，形成红体，随后形成黄体。成熟卵泡排出卵细胞后，形成红体，随后形成黄体。 黄体退化后由结缔组织填充，而成为白体。黄体退化后由结缔组织填充，而成为白体

18、。 2.1.12.1.1卵泡发育和排卵卵泡发育和排卵 v卵巢皮质部表层聚集着许多原始卵泡，由一个卵卵巢皮质部表层聚集着许多原始卵泡，由一个卵 原细胞和周围的单层扁平卵泡细胞组成。原细胞和周围的单层扁平卵泡细胞组成。 v成熟：随着卵泡的发育，经过成熟：随着卵泡的发育，经过初级卵泡、次级卵初级卵泡、次级卵 泡、生长卵泡和成熟卵泡泡、生长卵泡和成熟卵泡阶段，阶段，卵原细胞经过初卵原细胞经过初 级卵母细胞、次级卵母细胞，最终发育为卵子级卵母细胞、次级卵母细胞，最终发育为卵子， 由卵巢排出。由卵巢排出。 黄体及白体黄体及白体 子子 宫宫 v子宫是胎儿生长发育和娩出的器官。子宫是胎儿生长发育和娩出的器官。

19、 v子宫子宫 ( (uterus)uterus)大部分位于腹腔，少部分位于大部分位于腹腔，少部分位于 骨盆腔。背侧为直肠。腹侧为膀胱，前接输骨盆腔。背侧为直肠。腹侧为膀胱，前接输 卵管，后接阴道，借助于子宫阔韧带悬于腰卵管，后接阴道，借助于子宫阔韧带悬于腰 下腹腔。下腹腔。 v子宫角子宫体子宫颈子宫角子宫体子宫颈 牛的子宫牛的子宫 猪的子宫猪的子宫 2.2.卵子发生卵子发生 v卵子是受精的基础，作为配子的一方，卵子是受精的基础，作为配子的一方， 在卵泡中逐渐发育成熟。在卵泡中逐渐发育成熟。 v精子：提供遗传物质精子：提供遗传物质 v卵子：提供遗传物质，提供支持早期卵子：提供遗传物质，提供支持早

20、期 胚胎发育的营养胚胎发育的营养 2.12.1卵子形态结构卵子形态结构 v哺乳动物的卵子为圆球形，其直径大小因所含哺乳动物的卵子为圆球形，其直径大小因所含 的卵黄量不同，变异范围较大，透明带内卵黄的卵黄量不同，变异范围较大，透明带内卵黄 的直径为的直径为8080200um200um，为精子体积的，为精子体积的1 1万倍。万倍。 v家畜卵的直径一般小于家畜卵的直径一般小于185um185um，牛为，牛为120120 140um140um，绵羊，绵羊140140185um185um，猪，猪120120170um170um。 v雌性生殖细胞的分化、增殖、成熟全过程称为卵雌性生殖细胞的分化、增殖、成熟

21、全过程称为卵 子发生子发生 (oogenesis)(oogenesis)。 v卵子发生起始于胚胎早期，由原始卵原细胞经过卵子发生起始于胚胎早期，由原始卵原细胞经过 有丝分裂、减数分裂最后成为单倍体的卵细胞，有丝分裂、减数分裂最后成为单倍体的卵细胞， 持续时间很长，一般在初情期以后开始，至受精持续时间很长，一般在初情期以后开始，至受精 过程中才能完成。过程中才能完成。 2.22.2卵子发生特点卵子发生特点 v卵子发生和精子发生的过程很相似，都要经过卵子发生和精子发生的过程很相似，都要经过增殖增殖 期、生长期和成熟期期、生长期和成熟期三个阶段，但与精子发生相比三个阶段，但与精子发生相比 也有许多不

22、同之处。也有许多不同之处。 v首先，卵原细胞经过有丝分裂的增殖形成初级卵母首先，卵原细胞经过有丝分裂的增殖形成初级卵母 细胞细胞 ，初级卵母细胞经过两次减数分裂，每次分，初级卵母细胞经过两次减数分裂，每次分 裂均生成大小不等的两个细胞，小的称为极体。多裂均生成大小不等的两个细胞，小的称为极体。多 余的染色体被排出，最后形成一个成熟的卵子。余的染色体被排出，最后形成一个成熟的卵子。 v其次，哺乳动物的卵原细胞分裂形成初级卵母细胞其次，哺乳动物的卵原细胞分裂形成初级卵母细胞 都是在胎儿出生以前或出生后不久完成的。都是在胎儿出生以前或出生后不久完成的。 v在动物性成熟以前，卵母细胞不再增长，停留在第

23、在动物性成熟以前，卵母细胞不再增长，停留在第 一次减数分裂前期。一次减数分裂前期。 v到性成熟以后，每个性周期都会有部分卵母细胞发到性成熟以后，每个性周期都会有部分卵母细胞发 育，但多数卵母细胞在发育过程中退化，只有少数育，但多数卵母细胞在发育过程中退化，只有少数 卵母细胞发育到成熟并排卵。卵母细胞发育到成熟并排卵。 v卵母细胞在生长发育过程中要积累大量的营养物质卵母细胞在生长发育过程中要积累大量的营养物质 和遗传信息，为胚胎发育提供营养和信息。和遗传信息，为胚胎发育提供营养和信息。 v尽管哺乳动物的胚胎是在母体子宫内发育，可以直尽管哺乳动物的胚胎是在母体子宫内发育，可以直 接吸收母体的营养物

24、质，不像鸟类、两栖类、爬行接吸收母体的营养物质，不像鸟类、两栖类、爬行 类动物的卵需要存贮大量的卵黄物质，但一些母源类动物的卵需要存贮大量的卵黄物质，但一些母源 性性mRNA.tRNA.rRNAmRNA.tRNA.rRNA的合成还是必需的。的合成还是必需的。 三、卵的采集及体外成熟（实验）三、卵的采集及体外成熟（实验） 1.卵母细胞的离体采集卵母细胞的离体采集 母畜屠宰后，在母畜屠宰后，在30min内取出卵巢，放入盛有灭菌生理盐水内取出卵巢，放入盛有灭菌生理盐水 或或PBS的的保温瓶内（保温瓶内（2535）中）中，在，在3h内送回实验室，然后按内送回实验室，然后按 照下述方法进行回收。照下述方

25、法进行回收。 卵泡抽吸法：卵泡抽吸法： 用注射器套上用注射器套上1216号针头，保持一定负压，从卵泡的号针头，保持一定负压，从卵泡的侧面侧面 刺入刺入，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡。，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡。 卵泡解剖法：卵泡解剖法： 用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间的髄质部分，露出卵用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间的髄质部分，露出卵 泡，然后用刀片泡，然后用刀片划破卵泡划破卵泡，在培养液中反复冲洗，采集其中的卵母，在培养液中反复冲洗，采集其中的卵母 细胞。细胞。 （一）卵母细胞的采集方法（一）卵母细胞的采集方法 2.卵母细胞的活体采集卵母细胞的活体采集 因从屠宰场收集得到的

26、卵巢无法知道其因从屠宰场收集得到的卵巢无法知道其系谱系谱，且其，且其 种质一般相对种质一般相对较差较差，所以卵母细胞的活体采集是通过体，所以卵母细胞的活体采集是通过体 外受精技术生产良种胚胎的一种主要途径。如今，活体外受精技术生产良种胚胎的一种主要途径。如今，活体 采卵已成为当今应用体外受精和胚胎移植的一项关键技采卵已成为当今应用体外受精和胚胎移植的一项关键技 术。术。 腹腔镜法：腹腔镜法： B型超声波法：型超声波法： Egg retrieval, ultrasound image GIFT procedure, gamete intrafal- lopian transfer, laparo

27、scopy 配子输卵管 内移植 （GIFT） （二）卵母细胞的筛选（二）卵母细胞的筛选 只有周围包被着完整卵丘（只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落级）或部分卵丘脱落 （B级）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能级）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能 进行成熟与胚胎发育的培养。进行成熟与胚胎发育的培养。 （三）卵母细胞的体外成熟方法（三）卵母细胞的体外成熟方法 v37-3937-39度，度，5 5二氧化碳，二氧化碳，100100湿度湿度 1.成熟培养液的选择成熟培养液的选择 基础培养液基础培养液TCM199中的核苷、黄嘌呤和次黄嘌呤等对卵母细胞中的核苷、黄嘌呤和次黄嘌呤等对卵

28、母细胞 核成熟有抑制作用的成分浓度较低，培养的效果相对较好。核成熟有抑制作用的成分浓度较低，培养的效果相对较好。 体外成熟培养卵母细胞还要在基础液加入一定浓度的体外成熟培养卵母细胞还要在基础液加入一定浓度的血清血清（5 10的的FCS或或ECS）和）和促性腺素促性腺素（0.11.0g/ml FSH和和510g /ml LH等）等成分。等）等成分。 2.成熟培养的时间成熟培养的时间 对大多数家畜来讲，卵母细胞的成熟培养时间一般采用对大多数家畜来讲，卵母细胞的成熟培养时间一般采用2224h， 但是也要依据动物而定。但是也要依据动物而定。 3.成熟培养的温度和气相环境成熟培养的温度和气相环境 温度：

29、目前，除人和啮齿类动物的卵母细胞体外成熟仍采用温度：目前，除人和啮齿类动物的卵母细胞体外成熟仍采用 37外，牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用外，牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用38 39。 气象环境：气象环境： CO2的浓度：应根据培养液中的碳酸氢盐来定。由于目前培养的浓度：应根据培养液中的碳酸氢盐来定。由于目前培养 液中液中NaHCO3浓度多为浓度多为2530mmol/L，故一般都采用，故一般都采用5的的CO2。 4.成熟培养的系统成熟培养的系统 大致可分为三大类。大致可分为三大类。 开放培养系统：开放培养系统： 将将12ml成熟培养液直接置于平面皿内或五孔培

30、养板内，然成熟培养液直接置于平面皿内或五孔培养板内，然 后放入后放入50200枚卵母细胞进行培养，上面枚卵母细胞进行培养，上面不覆盖石蜡油不覆盖石蜡油。 微滴培养系统：微滴培养系统： 将成熟培养液先在组织培养皿中做成将成熟培养液先在组织培养皿中做成50500l的的 微滴，微滴，上覆石蜡油上覆石蜡油，然后将卵母细胞置于其中培养。，然后将卵母细胞置于其中培养。 在一般情况下，这种培养液用在卵母细胞数量特别在一般情况下，这种培养液用在卵母细胞数量特别 少的情况下采用。少的情况下采用。 密闭培养系统：密闭培养系统： 将卵母细胞置于含有将卵母细胞置于含有12ml成熟培养液的试管中，成熟培养液的试管中，

31、加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用 培养皿或微滴培养，则可将其装入一个密闭的塑料袋内。培养皿或微滴培养，则可将其装入一个密闭的塑料袋内。 IVF, in vitro fertilization, process v受精是两性配子受精是两性配子 ( (精子和卵子精子和卵子) )相互作用，结相互作用，结 合产生新的个体即合子合产生新的个体即合子(zygote)(zygote)的过程。的过程。 v通过受精，单倍体的雌、雄生殖细胞共同构通过受精，单倍体的雌、雄生殖细胞共同构 成双倍体的合子成双倍体的合子( (又称受精卵又称受精卵) )，合子

32、是新生，合子是新生 命发育的起点。命发育的起点。 v哺乳动物受精部位：哺乳动物受精部位：输卵管壶腹部输卵管壶腹部。 v有极少数的精子到达输卵管壶腹部。主要是有极少数的精子到达输卵管壶腹部。主要是 由于精子从射精部位到达受精部位需要闯过由于精子从射精部位到达受精部位需要闯过 三道关卡三道关卡，即经过三次筛选：，即经过三次筛选： 第一道关卡第一道关卡子宫颈。子宫颈。 第二道关卡第二道关卡子宫内膜腺。子宫内膜腺。 第三道关卡第三道关卡输卵管壶腹部和峡部的连接部。输卵管壶腹部和峡部的连接部。 v刚射出的精子不能穿入卵子，而只有在雌性刚射出的精子不能穿入卵子，而只有在雌性 生殖道内度过一段时间之后，才获

33、得受精能生殖道内度过一段时间之后，才获得受精能 力，称为力，称为“获能获能”(capacitation)(capacitation)。 v精子获能后，能释放出一系列水解酶，可将精子获能后，能释放出一系列水解酶，可将 包围在卵子周围的细胞和生物大分子物质包围在卵子周围的细胞和生物大分子物质( (蛋蛋 白质和黏多糖白质和黏多糖) )溶解出一条通路，便于精子进溶解出一条通路，便于精子进 入卵母细胞。入卵母细胞。 v获能过程先在子宫内进行，最后在输卵管内获能过程先在子宫内进行，最后在输卵管内 完成。完成。 v顶体反应顶体反应(acrosome reaction)(acrosome reaction)：

34、包裹精子：包裹精子 头部的质膜、顶体外膜融合和破裂，释放顶头部的质膜、顶体外膜融合和破裂，释放顶 体内含物的过程。体内含物的过程。 v这一反应是精子与卵子融合前必须经历的反这一反应是精子与卵子融合前必须经历的反 应之一，也是精子获能后的必然结果。应之一，也是精子获能后的必然结果。 v受精过程始于精子与卵子相遇，两性原核合并受精过程始于精子与卵子相遇，两性原核合并 形成合子时结束，分为五个步骤：形成合子时结束，分为五个步骤： v精子穿过放射冠精子穿过放射冠 v精子穿过透明带精子穿过透明带 v精子穿过卵质膜精子穿过卵质膜 v原核形成原核形成 v配子配合配子配合 原核形成原核形成 v精子入卵后不久，

35、头部开始膨大，核疏松，精子入卵后不久，头部开始膨大，核疏松， 核膜消失，失去固有的形态，最后在疏松的核膜消失，失去固有的形态，最后在疏松的 染色质外又形成新的核膜，这种重新形成的染色质外又形成新的核膜，这种重新形成的 核叫核叫雄原核雄原核。 v同时卵母细胞减数分裂恢复，释放第二极体。同时卵母细胞减数分裂恢复，释放第二极体。 卵中的染色质外又形成新的核膜，称卵中的染色质外又形成新的核膜，称雌原核雌原核。 配子配合配子配合 v雄原核和雌原核经充分发育，逐渐相向移动。雄原核和雌原核经充分发育，逐渐相向移动。 在卵子中央，核仁和核膜消失，两原核紧密在卵子中央，核仁和核膜消失，两原核紧密 接触，然后迅速

36、收缩，染色体重新组合，并接触，然后迅速收缩，染色体重新组合，并 准备进行第一次有丝分裂，形成一个称为准备进行第一次有丝分裂，形成一个称为 “合子合子”的单细胞胚胎。的单细胞胚胎。 第二节第二节 体外受精体外受精 v一、概述一、概述 v二、精子的制备及获能二、精子的制备及获能 v三、卵的采集及体外成熟三、卵的采集及体外成熟 v四、体外受精的方法四、体外受精的方法 v五、体外受精质量的评定五、体外受精质量的评定 v六、早期胚胎的体外培养六、早期胚胎的体外培养 v七、影响体外受精的因素七、影响体外受精的因素 v1998年我国首例试管婴儿诞生年我国首例试管婴儿诞生10周年时，张丽珠与周年时，张丽珠与

37、郑萌珠在一起。北京医科大学第三医院郑萌珠在一起。北京医科大学第三医院 2.2.历史历史 v19781978年年7 7月月2525日，第一例试管婴儿日，第一例试管婴儿Louise BrownLouise Brown在在 英国诞生，这是体外受精技术走向全面应用的标志英国诞生，这是体外受精技术走向全面应用的标志 性事件，是医学和生物学上的一次伟大的革命。性事件，是医学和生物学上的一次伟大的革命。 v而早在而早在18781878年，德国科学家年，德国科学家SchenkSchenk就开始进行哺乳就开始进行哺乳 动物卵子体外受精的尝试。动物卵子体外受精的尝试。 v18901890年，年，HeapeHeap

38、e用人工授精和体外受精技术研究兔用人工授精和体外受精技术研究兔 的胚胎移植，胚胎可成功发育直至降生。的胚胎移植，胚胎可成功发育直至降生。 直至直至20世纪世纪40年代，世界上也只有为数不多的科学家能成年代，世界上也只有为数不多的科学家能成 功的进行哺乳动物体外受精试验。美国的功的进行哺乳动物体外受精试验。美国的Pincus和日本的和日本的 Yamane是这时期的代表。是这时期的代表。 美籍华人张明觉在美籍华人张明觉在1945年曾成功的进行了兔体外受精，但年曾成功的进行了兔体外受精，但 在此后的在此后的5年里没有能再重复出这一结果。这个时期的体年里没有能再重复出这一结果。这个时期的体 外受精工作

39、主要建立在经验基础上。外受精工作主要建立在经验基础上。 v19511951年，年，ChangChang和澳大利亚的和澳大利亚的AustinAustin几乎同时发现几乎同时发现 只有在雌性生殖道内停留一段时间的精子才能成功只有在雌性生殖道内停留一段时间的精子才能成功 的与卵结合，进行体外受精。精子获能现象的发现的与卵结合，进行体外受精。精子获能现象的发现 是体外受精史上的一个是体外受精史上的一个里程碑里程碑。 v19591959年，年，ChangChang利用体内获能处理的精子进行体外利用体内获能处理的精子进行体外 受精实验，获得世界上首例受精实验，获得世界上首例“试管动物试管动物”试管试管 兔

40、，为哺乳动物体外受精工程奠定了基础。兔，为哺乳动物体外受精工程奠定了基础。 19631963年，年，YanagimachiYanagimachi和和ChangChang首次报道了成功首次报道了成功 进行精子体外获能的实验（金黄仓鼠）。进行精子体外获能的实验（金黄仓鼠）。 v19701970年，年，MukherjeeMukherjee和和CohenCohen，小鼠。，小鼠。 v19781978年年7 7月月2525日，日，第一例试管婴儿第一例试管婴儿Louise Brown 在英国诞生（在英国诞生（Steptoe和和Edwards），这是体外），这是体外 受精技术走向全面应用的标志性事件，是医学

41、和受精技术走向全面应用的标志性事件，是医学和 生物学上的一次伟大的革命。生物学上的一次伟大的革命。 v19891989年，陈大元等首次成功进行大熊猫精子年，陈大元等首次成功进行大熊猫精子 体外获能，体外获能的大熊猫精子能与金黄体外获能，体外获能的大熊猫精子能与金黄 地鼠卵子相互作用。地鼠卵子相互作用。 v19901990年，年，MillerMiller和和AxAx相继进行了美洲虎和美相继进行了美洲虎和美 洲豹的体外受精，并于同年获得美洲虎体外洲豹的体外受精，并于同年获得美洲虎体外 受精后代。受精后代。 80 80年代以来，由于对胚胎需求量的加大，促进了家年代以来，由于对胚胎需求量的加大，促进了

42、家 畜体外受精的研究，牛、羊、猪等相继获得了成功，畜体外受精的研究，牛、羊、猪等相继获得了成功， 国内在国内在80-9080-90年代也在家畜上取得了成功。年代也在家畜上取得了成功。 现已将卵母细胞体外成熟现已将卵母细胞体外成熟体外受精体外受精早期胚体外早期胚体外 发育，甚至冷冻保存结合在一起，建立工厂化生产发育，甚至冷冻保存结合在一起，建立工厂化生产 胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎。胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎。 v与人工授精相比，体外受精所需精子数减少，与人工授精相比，体外受精所需精子数减少， 精液利用率提高。精液利用率提高。 二、精子的制备及获能二、精子的制备及获能

43、 1.取精取精 大鼠（公）大鼠（公） 2.精子的分离与制备是精子的分离与制备是IVF的一个关键环节的一个关键环节 精液中的精子获能抑制因子精液中的精子获能抑制因子 冷冻精液中的防冻剂和蛋黄等成分冷冻精液中的防冻剂和蛋黄等成分 影响和干扰受精的完成影响和干扰受精的完成 过多的留在受精液中的死精子过多的留在受精液中的死精子 悬浮法（悬浮法（swim up）：）： 是筛选高活力精子是筛选高活力精子最为有效最为有效的一种方法。的一种方法。 玻璃棉（玻璃棉（glasswool）过滤法：）过滤法： 该法可有效地滤除品质较差精液中的死精子，大大该法可有效地滤除品质较差精液中的死精子，大大 提高精子的受精穿透

44、率。提高精子的受精穿透率。 方法：方法： BSA/哌可（哌可（Percoll）密度梯度离心法：）密度梯度离心法： 采用不连续的采用不连续的BSA密度梯度可以分离得到形态正密度梯度可以分离得到形态正 常的高活力精子。常的高活力精子。 离心洗涤法：离心洗涤法： 对于精子对于精子活力较好活力较好的精液可采用直接离心洗涤法的精液可采用直接离心洗涤法 制备用于体外受精的精子。制备用于体外受精的精子。 3.精子获能原理精子获能原理 v任何可导致精子被膜蛋白脱除，质膜稳定性下降，通透性任何可导致精子被膜蛋白脱除，质膜稳定性下降，通透性 增加和增加和Ca2+ 内流的处理方法，均能诱发精子的获能。内流的处理方法

45、，均能诱发精子的获能。 v精子获能后发生一系列明显变化，代谢活动显著增强，摄精子获能后发生一系列明显变化，代谢活动显著增强，摄 氧量增加氧量增加2-4倍，运动速度加快，头部膨大，极易发生倍，运动速度加快，头部膨大，极易发生顶顶 体反应。体反应。 母畜生殖道内的获能因子中和 精子表面的去能因子 精子质膜的胆固醇外流 Ca2+进入精子内部 膜的通透性增加 获能完成 膜蛋白重新分布，膜的稳定性 下降 cAMP浓度升高 激活腺苷酸环化酶 抑制磷酸二酯酶 体内获能：把精子送入结扎的子宫角或输卵管中孵育体内获能：把精子送入结扎的子宫角或输卵管中孵育 与血清白蛋白的溶液长时间孵育：与血清白蛋白的溶液长时间孵

46、育： 原理是血清中白蛋白具有很强原理是血清中白蛋白具有很强结合结合胆固醇和锌离子的能力，胆固醇和锌离子的能力， 可可除去质膜中部分胆固醇和锌离子除去质膜中部分胆固醇和锌离子，改变精子质膜的稳定性，导，改变精子质膜的稳定性，导 致精子获能。致精子获能。 用高离子强度溶液处理精子：用高离子强度溶液处理精子： 精子表面的精子表面的去能因子去能因子（被膜蛋白），当用高离子强度溶液（被膜蛋白），当用高离子强度溶液 处理精子时，将从精子的处理精子时，将从精子的表面脱落表面脱落，从而导致精子获能。，从而导致精子获能。 与含有卵泡液的培养液进行孵育：与含有卵泡液的培养液进行孵育： 4. 精子体外获能的方法精子

47、体外获能的方法 使用钙离子载体使用钙离子载体A23187： 直接诱发直接诱发Ca2+进入精子细胞内部，进入精子细胞内部，提高提高细胞内的细胞内的Ca2+浓度，浓度， 从而导致精子获能。从而导致精子获能。 使用肝素：使用肝素： 是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，当它与精子结合是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，当它与精子结合 后，能引起后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子的获能。是一种进入精子细胞内部而导致精子的获能。是一种接接 近于体内获能的近于体内获能的生理性生理性方法方法，已经成为动物体外受精，已经成为动物体外受精应用最广应用最广的的 一种精子获能方法。一种精子获能方法。 四、体

48、外受精的方法四、体外受精的方法 体外受精的完成需要一个有利于精子和卵子存活的体外受精的完成需要一个有利于精子和卵子存活的 培养系统。培养系统。 微滴法：微滴法： 是在塑料培养皿中用受精液做成是在塑料培养皿中用受精液做成2040l的的 微滴，微滴，上覆石蜡油上覆石蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵母，然后每滴放入体外成熟的卵母 细胞细胞1020枚及获能处理的精子（枚及获能处理的精子（1.01.5） 106个个/ml，在培养箱中孵育，在培养箱中孵育624h。 四孔培养板法：四孔培养板法： 每孔加入每孔加入500l受精液和受精液和100150枚体枚体 外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精外成熟的卵母细

49、胞，然后加入获能处理的精 子（子（1.01.5）106个个/ml，而后在培养箱，而后在培养箱 中孵育中孵育624h。 五、体外受精质量的评定五、体外受精质量的评定 v体外受精成功的判断指标：体外受精成功的判断指标： v精子穿透率精子穿透率 v原核形成率原核形成率 v卵裂率卵裂率 v囊胚率囊胚率 v通过染色或胚胎培养通过染色或胚胎培养 六、早期胚胎的体外培养六、早期胚胎的体外培养 对于一些采用对于一些采用非手术法非手术法将胚胎移植的家畜来说，体将胚胎移植的家畜来说，体 外受精后的早期胚胎必须在体外培养至外受精后的早期胚胎必须在体外培养至桑椹胚或囊胚桑椹胚或囊胚阶阶 段才能移植；而对于那些采用段才

50、能移植；而对于那些采用手术法手术法移植胚胎的动物，移植胚胎的动物， 将受精卵培养成囊胚再移植，亦有可能将受精卵培养成囊胚再移植，亦有可能提高移植妊娠率提高移植妊娠率， 因体外受精的胚胎并不是都能发育到囊胚阶段。因体外受精的胚胎并不是都能发育到囊胚阶段。 因此，早期胚胎的体外培养是胚胎体外生产技术中非常因此，早期胚胎的体外培养是胚胎体外生产技术中非常 关键的一个环节。关键的一个环节。 （一）胚胎体外培养的发育阻断（一）胚胎体外培养的发育阻断 随着胚胎的发育，合子的基因开始启动转随着胚胎的发育，合子的基因开始启动转 录，其代谢活动逐步录，其代谢活动逐步由母源的由母源的mRNA控制向合控制向合 子本

51、身的子本身的mRNA控制过渡控制过渡，在这一过渡时期，在这一过渡时期， 胚胎对所处的环境条件特别敏感，稍有不适便胚胎对所处的环境条件特别敏感，稍有不适便 表现出不可逆的发育阻断。（门槛）表现出不可逆的发育阻断。（门槛） v在进行哺乳动物胚胎体外培养时，若胚胎所处在进行哺乳动物胚胎体外培养时，若胚胎所处 的条件不当，就会出现体外发育阻断，即早期的条件不当，就会出现体外发育阻断，即早期 胚胎停顿在某个特定时期，甚至不能发育。胚胎停顿在某个特定时期，甚至不能发育。 v在体内正常的生理条件下，胚胎从输卵管和子在体内正常的生理条件下，胚胎从输卵管和子 宫腺体壁吸取营养，保证其正常的发育。宫腺体壁吸取营养

52、，保证其正常的发育。 v体外模拟动物体内的环境条件体外模拟动物体内的环境条件 发育阻断的出现时间与发育阻断的出现时间与合子基因启动的时间合子基因启动的时间有关，而有关，而 且发育阻断的出现与否也是胚胎质量和培养条件相互作用且发育阻断的出现与否也是胚胎质量和培养条件相互作用 的结果，在一定的培养条件下，某些特定品系的多数胚胎的结果，在一定的培养条件下，某些特定品系的多数胚胎 不表现发育阻断，而通过改善培养条件亦能提高通过发育不表现发育阻断，而通过改善培养条件亦能提高通过发育 阻断的胚胎比率。阻断的胚胎比率。 小鼠：小鼠：2细胞细胞 牛羊：牛羊：8-16细胞细胞 猪：猪： 4细胞细胞 人：人： 4

53、-8细胞细胞 使胚胎通过发育阻断，一直是胚胎体外培养研究的使胚胎通过发育阻断，一直是胚胎体外培养研究的 热点。热点。 经过多年的研究，经过多年的研究，与体细胞共培养是与体细胞共培养是促使胚胎通过促使胚胎通过 发育阻断最为有效的途径，而且随着近几年研究工发育阻断最为有效的途径，而且随着近几年研究工 作的不断深入，胚胎发育阻断也可以通过作的不断深入，胚胎发育阻断也可以通过改善培养改善培养 条件条件和在培养液中和在培养液中添加生长因子添加生长因子（TGF和和bFGF 等）或等）或细胞外基质因子细胞外基质因子（如肝素纤粘蛋白）克服。（如肝素纤粘蛋白）克服。 （二）培养液的基本成分及其功能（二）培养液的

54、基本成分及其功能 培养液的基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生培养液的基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生 素、碳水化合物和蛋白质等，按其功能可分为渗透压维素、碳水化合物和蛋白质等，按其功能可分为渗透压维 持因子、代谢底物和代谢调节因子等。持因子、代谢底物和代谢调节因子等。 1.无机盐：培养液中主要包括无机盐：培养液中主要包括Na+、Cl 、 、K+、 Mg2+、Ca2+、PO43 、 、SO42 和 和HCO3 等。 等。 2.能量底物：主要包括葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠能量底物：主要包括葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠 和谷氨酰氨等。和谷氨酰氨等。 3.氨基酸：是蛋白质合成的前体，也参与胚胎的能氨基

55、酸：是蛋白质合成的前体，也参与胚胎的能 量代谢，就单一氨基酸的作用而论，天冬氨酸、天冬酰氨、量代谢，就单一氨基酸的作用而论，天冬氨酸、天冬酰氨、 甘氨酸、组氨酸对胚胎发育均起促进作用，而半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸对胚胎发育均起促进作用，而半胱氨酸、 亮氨酸、苏氨酸和颉氨酸起抑制作用。亮氨酸、苏氨酸和颉氨酸起抑制作用。 4.维生素：它作为碳水化合物和氨基酸代谢过程中维生素：它作为碳水化合物和氨基酸代谢过程中 必不可少的成分，能促进细胞对葡萄糖的摄取和乳糖的合必不可少的成分，能促进细胞对葡萄糖的摄取和乳糖的合 成，从而影响胚胎的代谢和发育。成，从而影响胚胎的代谢和发育。 5.生物体液和蛋白质：在基础液中添加一定比例的生物体液和蛋白质：在基础液中添加一定比例的 卵泡液、子宫分泌液和输卵管分泌液则对胚胎的发育具有卵泡液、子宫分泌液和输卵管分泌液则对胚胎的发育具有 促进作用。促进作用。 6.激素：是胚胎发育的调节因子。激素对胚胎体外激素：是胚胎发育的调节因子。激素对胚胎体外 发育的影响具有明显的阶段性。发育的影响具有明显的阶段性。 7.生长因子及多肽：在培养液中添加生长因子，能生长因子及多肽：在培养液中添加生长因子，能 使胚胎通过发育阻断，并能增加胚胎的细胞数和提高胚使胚胎通过发育