第1章 植组织培养实验室的构建和操作技术

1、第第1 1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室 构建及操作技术构建及操作技术 大大 家家 好好 ！植物组织培养学植物组织培养学本章教学目的与要求：本章教学目的与要求：l(1)掌握组织培养实验室的设计；掌握组织培养实验室的设计；l(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；l(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。掌握调控组织培养的主要环境条件。l(4)掌握灭菌和消毒的区别；掌握灭菌和消毒的区别；l(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；l(6)掌握无菌接种的步骤；掌握无菌接种的步骤；l(7)掌握外植体的培养

2、方法和步骤；掌握外植体的培养方法和步骤；l(8)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；l(9)掌握试管苗驯化的基本程序；掌握试管苗驯化的基本程序；第第1 1章章 植物组织培养实植物组织培养实验室构建及操作技术验室构建及操作技术第第1 1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室 构建及操作技术构建及操作技术植物组织培养学植物组织培养学p 商业性组织培养实验室和小工厂的商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备设计与主要设备p 培养基及其配制培养基及其配制p 外植体的选择与培养外植体的选择与培养p 试管苗的驯化与移栽试管苗的驯化与移栽 第第1 1章章 植物

3、组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术 1 1、培养器皿的清洗；、培养器皿的清洗； 2 2、培养基的配制、分装和高压灭菌；、培养基的配制、分装和高压灭菌； 3 3、无菌操作、无菌操作材料的表面灭菌和接种；材料的表面灭菌和接种； 4 4、将培养物放到培养室培养；、将培养物放到培养室培养； 5 5、试管苗的驯化、移栽和初期管理。、试管苗的驯化、移栽和初期管理。第第1 1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术第一节第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的商业性组织培养实验室和小工厂的 设计与主要设备设计与主要设备一般组织培养的操作工序：一般组织培养

4、的操作工序：一、设计：一、设计：第一节第一节 组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备二、仪器设备和器皿用具二、仪器设备和器皿用具1、超净工作台或接种箱、超净工作台或接种箱2、空调、空调3、除湿机或加湿器、除湿机或加湿器4、恒温培养箱、恒温培养箱5、高压灭菌锅、高压灭菌锅6、冰箱、冰箱7、天平、天平8、显微镜、显微镜9、水浴锅、水浴锅10、摇床与转床、摇床与转床11、蒸馏水发生器、蒸馏水发生器12、酸度计、酸度计13、离心机、离心机第一节第一节 组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备1、培养器皿：、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、试管、三角瓶、培养

5、皿、 圆形培养瓶、果酱瓶圆形培养瓶、果酱瓶2、分注器、分注器3、离心管、离心管4、刻度移液管、刻度移液管5、细菌过滤器、细菌过滤器6、实验器皿：、实验器皿：量筒、烧杯、容量瓶、量筒、烧杯、容量瓶、 试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。第一节第一节 组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备1 1、镊子：尖头镊子、枪形镊子、镊子：尖头镊子、枪形镊子2 2、剪子、剪子3 3、解剖刀、解剖刀4 4、接种针、接种针5 5、钻孔器、钻孔器第一节第一节 组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制本节目的要求：

6、本节目的要求：(1)(1)一般掌握培养基的种类、特点；一般掌握培养基的种类、特点；(2)(2)掌握基本培养基的配方；掌握基本培养基的配方；(3)(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4)(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；(5)(5)熟练掌握培养基的灭菌方法；熟练掌握培养基的灭菌方法；(6)(6)一般掌握培养基的筛选办法。一般掌握培养基的筛选办法。 第第1 1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术一、培养基的成分一、培养基的成分第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制培

7、养基组成培养基组成1、无机营养元素、无机营养元素(inorganic element) 1)1)大量元素：大量元素：指浓度大于指浓度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 NN、P P、K K、MgMg、S S和和CaCa等等 。2)2)微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 FeFe，B B，MnMn，CuCu，MoMo，CoCo等等 。 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制2、有机化合物、有机化合物(organic compound) F最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好

8、的碳源。F 使用浓度在使用浓度在1%5%，常用，常用3%F 作用：碳源；维持培养基渗透压。作用：碳源；维持培养基渗透压。 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制l在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。l种类：种类：VBl(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、 VB6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸烟酸)、 Vc（抗坏血酸）、（抗坏血酸）、 VH(生物素生物素)、 VB11(叶酸叶酸)、 VB12（钴胺素（钴胺素)等。等。l使用浓度：使用浓度：一般用量为一般用量为0.11.0mgL。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制l又叫环己六醇

9、，在糖类的相互转化中起重要作用。又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。l使用浓度使用浓度：一般为：一般为lOOmglOOmgL L，l作用作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制l作用作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。收利用。l种类种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨

10、酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。氨酸等。l使用浓度使用浓度：为：为10200mg10200mgL L。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制3、有机附加物、有机附加物 （天然复合物）（天然复合物）第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制椰乳椰乳香蕉香蕉马铃薯马铃薯酵母提取液酵母提取液4、植物生长调节物质、植物生长调节物质(hormone) 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制 * *作用作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。

11、 在促进生长方面，根对生长素最敏感。在在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，极低的浓度下，(10(10-5-51010-8-8mgmgL)L)就可促进生就可促进生长，其次是茎和芽。长，其次是茎和芽。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid）萘乙酸：萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid）吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid）2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 第二节第二节 培养基及其配制培养基及

12、其配制IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4D(2,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)生长素作用强弱顺序：生长素作用强弱顺序：强强弱弱第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制种类：种类：l6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)lKt (kinetin 激动素激动素)lZt (zeatin 玉米素玉米素) 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制Kt ( 激动素激动素)6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Zt (玉米素玉米素)细胞分裂素作用强弱顺序细胞分裂素作用强弱顺序强强弱弱第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制GAGA3 3（赤霉酸）：（赤霉酸）：作用作用：

13、促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。植株。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当有影响：当生长素赤霉素比值高生长素赤霉素比值高时有利于时有利于木木质部质部分化，分化，比值低比值低时有利于时有利于韧皮部韧皮部分化。分化。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制5 5、培养材料的支持物、培养材料的支持物 -琼脂琼脂(agar) (agar) l固体培养时最好的固体培养时最好的固化剂固化剂。 l用量：用量：610g610gL L。l琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并琼脂是一种由海藻中提取的高

14、分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至却至40 40 即凝固为固体状凝胶。即凝固为固体状凝胶。l琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与与高压灭菌时的温度、时间、高压灭菌时的温度、时间、pHpH值值等因素有关，长时间等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。逐渐丧失凝固能

15、力。 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制固体培养基的特点（与液体培养基相比）固体培养基的特点（与液体培养基相比）: :优点优点: :操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。缺点缺点: :培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触( (即吸收即吸收) )面积小，各种养分在面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。固体培养固体培养液体培养液体培养第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制

16、6、抗生物质、抗生物质(antibiotic) l种类：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。青霉素、链霉素、庆大霉素等。l浓度：浓度：520mg/L。l作用：作用：可可防止菌类污染防止菌类污染。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制7、活性炭、活性炭(active carbon) l目的：目的：是是利用其吸附能力，减少一些有毒物利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响质的影响；利于生根。；利于生根。l使用浓度：使用浓度：15gL。l它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚

17、至不吸附。附力减弱，甚至不吸附。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制作用：作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。代谢过程的介质和溶媒。 注意：注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。水。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制二、培养基的二、培养基的PH值值 (pH value)1、多数植物要求、多数植物要求pH5.6-5.82、用、用0.1-1N的的NaOH和和0.1-1N的的HCI调节调节. .3、注意：注意：p

18、经高压灭菌后，培养基经高压灭菌后，培养基pHpH会下降会下降0.2-0.8,0.2-0.8,固固调整调整pHpH值时值时, ,应高于应高于0.50.5；ppHpH的大小会影响琼脂的凝固能力，当的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH6.0pH6.0时，培养基将会变硬，时，培养基将会变硬，pH 5.0pH 5.0时，琼脂凝固时，琼脂凝固不好。不好。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制种类种类最适最适pH值值种类种类最适最适pH值值杜鹃杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡萝卜、石刁柏胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制不同植物对

19、培养基最适不同植物对培养基最适pH值的要求不同值的要求不同(见表见表) 培养基培养基(culture medium) ：是植物组织培是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培系统时，首先必须找到一合适的培养基，培

20、养才有可能成功。养才有可能成功。 三、培养基的种类、配方及特点三、培养基的种类、配方及特点第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、 生根培养基生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、 改良培养基。改良培养基。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制F 若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物若只含有

21、大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为的培养基，称为基本培养基基本培养基。F 在基本培养基的基础上，添加各种各样的生在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全完全培养基。培养基。初代培养基：初代培养基： 指用来第一次接种外植体的培养基。指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：继代培养基：指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基 。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制母液名称母液名称 药品药品 名称名称 原配方量原配方量 (mg)/ L大量元素母液大量元素母液 NH4N

22、O31650KNO31900CaCl2H2O440MgSO4 7H2O370KH2PO4170微量元素母液微量元素母液 MnSO4H2O22.3ZnSO47H2O8.6CoCl6H2O0.025CuSO45H2O0.02H3BO36.2Na2MO42H2O0.25KI0.83铁盐母液铁盐母液 FeSO47H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物母液有机物母液 烟酸烟酸(Vpp)0.5盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素 0.1肌醇肌醇 100甘氨酸甘氨酸 2第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制1 1、MSMS培养基：培养基：它是它是19621962年由年由Murashig

23、eMurashige和和SkoogSkoog为为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。养基。 特点：特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的是无机盐离子浓度较高，有高含量的N N、K K，硝酸盐量大，营养丰富。硝酸盐量大，营养丰富。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制2 2、WhiteWhite培养基：培养基：19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根为培养番茄根尖而设计的。尖而设计的。特点：特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。无机盐浓度较低，适于生根培养。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制(4)B(4)B5 5培养

24、基培养基: :是是19681968年由年由GalmborgGalmborg等为培养大豆等为培养大豆根细胞而设计的。根细胞而设计的。特点：特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。硫胺素。(5)KM8P(5)KM8P培养基培养基: :它是它是19741974年为原生质体培养而年为原生质体培养而设计的。设计的。特点：特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。和维生素。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制 四、四、 培养基的配制培养基的配制 （一）、母液（一）、母液(stock solution)的配制和

25、保存的配制和保存l所谓所谓母液母液是欲配制液的是欲配制液的浓缩液浓缩液。l意义意义: 保证各物质成分的准确性保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取配制时的快速移取 便于低温保藏。便于低温保藏。l一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-10010-100倍。倍。l母液配制时可分别配成母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等盐、有机物和激素类等。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制l单配法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用定浓度的母液。一般用mg/ml mg/ml 或或

26、mg/Lmg/L表示。表示。l混配法：混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。l配制生长素类：配制生长素类：可先用少量可先用少量0.1N0.1N的的NaOHNaOH或或95%95%酒精助溶酒精助溶。浓度为：。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。l配制细胞分裂素类：配制细胞分裂素类：一般先用少量一般先用少量0.5-1N0.5-1N盐酸加盐酸加热溶解热溶解。浓度为：。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制 母液的配制方法：母液的配制方法： 培养基母

27、液的配制培养基母液的配制 母液名称母液名称 药品药品 名称名称 原配方量原配方量 (mg)/ L扩大倍数扩大倍数 称取量称取量 (mg) 母液体积母液体积 (ml) 移取量移取量 (ml)/L 大量元素母液大量元素母液 NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl2H2O44010 4400MgSO4 7H2O370103700KH2PO417010 1700微量元素母液微量元素母液 MnSO4H2O22.31002230100010ZnSO47H2O8.6100860CoCl6H2O0.0251002.5CuSO45H2O0.0210025H3BO3

28、6.2100620Na2MO42H2O0.25100 25KI0.83100 83铁盐母液铁盐母液 FeSO47H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液有机物母液 烟酸烟酸(Vpp)0.5502550010盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.55025盐酸硫胺素盐酸硫胺素 0.1505肌醇肌醇 100505000甘氨酸甘氨酸 250100第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制（二）培养基的配制及其灭菌（二）培养基的配制及其灭菌l1.配制方法：配制方法：1 1、将母液按顺序摆放、将母液按顺序摆放2 2、取适量的蒸馏水、取适量的蒸馏水( (所需培养基量的所

29、需培养基量的2/3)2/3)入容器入容器3 3、按需要量依次取母液及生长调节物质、按需要量依次取母液及生长调节物质4 4、加入蔗糖、加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解5 5、加琼脂、加琼脂(6-10g/L)(6-10g/L)，煮沸，煮沸，2-3min2-3min5 5、定容、定容6 6、调、调PHPH值值(pH=5.8)(pH=5.8)7 7、分装培养瓶，封口、分装培养瓶，封口8 8、高压灭菌、高压灭菌第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制l组织培养常见的灭菌方法l消毒消毒:是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。使之不再发生危害作用。l灭菌灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物体表是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。生命的物质全部杀死。第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制常用的灭菌方