第八章 蛋白质和氨基酸的测定

1、第八章第八章 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 第一节第一节 概述概述 一、蛋白质的生理功用及在食品中的作用一、蛋白质的生理功用及在食品中的作用 蛋白质是生命的物质基础。蛋白质是生命的物质基础。 蛋白质是人体重要的营养物质。蛋白质是人体重要的营养物质。 蛋白质是食品的重要质量指标。蛋白质是食品的重要质量指标。 1. 二、蛋白质系数二、蛋白质系数 含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志 。 不同蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，不同蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同， 故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白

2、一般蛋白 质含氮量为质含氮量为16%，即一，即一 份氮相当于份氮相当于6.25份蛋白质，份蛋白质， 此数值（此数值（6.25）称为蛋白质系数。）称为蛋白质系数。 一般食物为一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为；纯乳与纯乳制品为6.38； 面粉为面粉为5.70；玉米、高粱为；玉米、高粱为6.24；花生为；花生为5.46；大；大 米为米为5.95；大豆及其粗加工制品为；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋；大豆蛋 白制品为白制品为6.25；肉与肉制品为；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、；大麦、小米、 燕麦、裸麦为燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为；芝麻、向日葵为5.30；复合；复合 配方食品为

3、配方食品为6.25。 三、氨基酸三、氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，8 种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食 品提供，品提供，必需氨基酸必需氨基酸 四、蛋白质的测定方法四、蛋白质的测定方法 蛋白质是生命的物质基础，人体蛋白质是生命的物质基础，人体11%13% 总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白 质，只是含量及类型不同。质，只是含量及类型不同。 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和 折射率等测定蛋白质含量；折射率等测定蛋白质含量；

4、另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性 和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。 食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也 是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一 个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以 只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的 要单测）。要单测）。 具体测定方法：具体测定方法： 凯氏定氮法凯氏定氮法最常用的，国内外

5、应用普遍。最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应双缩脲反应 染料结合反应染料结合反应 酚试剂法酚试剂法 国外：国外： 红外分析仪红外分析仪 氨基酸总量氨基酸总量酸碱滴定法测定。酸碱滴定法测定。 各种氨基酸的分离与定量各种氨基酸的分离与定量色谱技术。色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。有多种氨基酸分析仪。 第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合 并变色。书中列举了并变色。书中列举了 5 种染料。种染料。 二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白

6、的显色（一）糖蛋白的显色（3种方法）种方法） （二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2种方法）种方法） 第三节第三节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定 一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物 性食品。例如牛肉中蛋白质含量为性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，左右， 猪肉猪肉 9.5%， 兔肉兔肉 21%， 鸡肉鸡肉 20%， 牛乳牛乳 3.5%， 带鱼带鱼 18.0%， 大豆大豆 40%， 面粉面粉 9.9%， 菠菜菠菜 2.4%， 黄瓜黄瓜 1.0%， 苹果苹果 1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的测定食品中的蛋白质的含量，

7、对于评价食品的 营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质 量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控 制均具有极其重要的意义。制均具有极其重要的意义。 一些蛋白质的含氮量一些蛋白质的含氮量 一般为一般为 15% 17.6%，有的上下浮动，有的上下浮动,可以测可以测 出总氮出总氮 N. 16% N = N6.25 = 蛋白质含量蛋白质含量 一、 凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，现发展为常量、微量、年提出，现发展为常量、微量、 自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏

8、法。 过程：是通过测出样品中的总含氮量再乘以相过程：是通过测出样品中的总含氮量再乘以相 应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中 含有少量非蛋白质含氮化合物（如核酸、含氮碳水含有少量非蛋白质含氮化合物（如核酸、含氮碳水 化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色 素），故此法的结果称为粗蛋白质含量。素），故此法的结果称为粗蛋白质含量。 适用范围：可用于所有动、植物食品的分析及适用范围：可用于所有动、植物食品的分析及 各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，是经各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，是经

9、典分析方法。典分析方法。 （一）微量凯氏定氮法（一）微量凯氏定氮法 1. 原理原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使 蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水 逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成 硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 用用H3BO3吸收后再以标准吸收后再以标准HCl溶液滴定。根溶液滴定。根 据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 2.过程：消化、蒸馏、吸收与滴定过程：消化、蒸馏、吸

10、收与滴定 1）消化）消化 总反应式：总反应式： 加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，作为增温剂，提高溶液沸点， 纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾之后可以提高 至至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%） 加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时 碱性指示剂）。还可以加

11、氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒 粉、二氧化钛。粉、二氧化钛。 加氧化剂加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。物氧化速度。 98%浓硫酸浓硫酸 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，浓硫酸具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳， 硫酸则被还原成二氧化硫。硫酸则被还原成二氧化硫。 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨

12、随 之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 2） 蒸馏蒸馏 消化液消化液 + 400g/L氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。 3）吸收与滴定）吸收与滴定 用用20g/L硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂 用混合指示剂。用混合指示剂。 甲基红甲基红溴甲基酚绿指示剂（变色点呈灰色，溴甲基酚绿指示剂（变色点呈灰色，pH5.1） 指示剂指示剂 酒红色酒红色 蓝绿色蓝绿色 酒红色酒红色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸） 亚甲基蓝亚甲基蓝+甲基红指示剂（变色点呈灰色，甲基红指示剂（变色点呈灰色，pH5

13、.4） 指示剂指示剂 紫红色紫红色 蓝绿色蓝绿色 （酸）（酸） （碱）（碱） 吸收吸收滴定滴定 3.操作方法操作方法 1）样品消化）样品消化 准确称取均匀的固体样品准确称取均匀的固体样品0.202.00g， 或半固体样品或半固体样品2.005.00g，或吸取液体试样，或吸取液体试样 10.0025.00 (约相当于约相当于30-40mg氮氮)。小心移。小心移 入干燥的入干燥的100mL或或500mL定氮瓶中定氮瓶中(勿粘附在勿粘附在 瓶壁上瓶壁上)。 加入加入0.g硫酸铜、硫酸铜、g硫酸钾及硫酸钾及2mL浓浓 硫酸，稍摇匀后，于瓶口放一小漏斗，将瓶硫酸，稍摇匀后，于瓶口放一小漏斗，将瓶 以以4

14、5角倾斜支于电炉上（在通风橱内加热角倾斜支于电炉上（在通风橱内加热 消化）。消化）。 3.操作方法操作方法 先以小火缓慢加热，待内容物全部炭化、先以小火缓慢加热，待内容物全部炭化、 泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液 体微沸，至溶液呈蓝绿色清澈透明后，再继体微沸，至溶液呈蓝绿色清澈透明后，再继 续加热续加热0.5-1h。 取下冷却至室温，小心加取下冷却至室温，小心加20mL水。放冷水。放冷 后，移入后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定容量瓶中，并用少量水洗定 氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度， 混匀备用。

15、同时做试剂空白试验。混匀备用。同时做试剂空白试验。 仪器：仪器： 消化装置消化装置 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装 水至三分之二处，加入数粒玻璃珠，加甲水至三分之二处，加入数粒玻璃珠，加甲 基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水 呈酸性，用调压器控制，加热煮沸水蒸气呈酸性，用调压器控制，加热煮沸水蒸气 发生瓶内的水。发生瓶内的水。 向接收瓶内加入向接收瓶内加入10mL硼酸溶液（硼酸溶液（20g/L）及）及 1-2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入 接受瓶液面

16、下。接受瓶液面下。 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收 准确吸取准确吸取10mL试样处理液，由小漏斗慢慢流试样处理液，由小漏斗慢慢流 入反应室，并以入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使流入反水洗涤小烧杯使流入反 应室内，棒状玻塞塞紧。应室内，棒状玻塞塞紧。 将将10mL氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（400g/L）倒入小玻杯，）倒入小玻杯， 提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖 紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹， 开始蒸馏。开始蒸馏。 蒸馏蒸馏5min，移动接收瓶，将冷凝管下端离开液，移动接收瓶，将冷凝管下端离开液

17、面继续蒸馏面继续蒸馏1min，然后用少量蒸馏水冲洗冷凝，然后用少量蒸馏水冲洗冷凝 管下端外部，取下接收瓶，停止蒸馏。管下端外部，取下接收瓶，停止蒸馏。 3）滴定）滴定 以硫酸或盐酸标准滴定溶液（以硫酸或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）滴定至灰）滴定至灰 色或蓝紫色为终点。色或蓝紫色为终点。 同时准确吸取同时准确吸取10mL试剂空白消化液操作。试剂空白消化液操作。 4.计算计算 注意：注意：F氮换算为蛋白质的系数，一般为氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25 也也 可查表。可查表。 计算结果保留三位有效数字。计算结果保留三位有效数字。 100 100 10 1000 )( )100/10

18、0/( 21 F m M VVc mLggg或蛋白质含量 5.注意事项：注意事项： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以 免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无 硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损 失。失。 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利 用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下， 并促进其消化完全。并促进其消化完全。 仪器：仪器： 消化装置消化装

19、置 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产 生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开 始消化时应用小火加热，并时时摇动；或始消化时应用小火加热，并时时摇动；或 者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂， 并同时注意控制热源强度。并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏 烧瓶冷却，加入烧瓶冷却，加入30过氧化氢过氧化氢 23 mL 后后 再继续加热消化再继续加热消化。 若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每可按每

20、 克试样克试样5 mL的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化30min即即 可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的 样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨 酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有 机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色， 但含铁量多时，呈较深绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置应平稳牢固，各连接部位不得漏蒸馏装置应平稳牢固，各连接部位不得漏 气，水蒸气发生应均匀充足。蒸

21、馏过程中不气，水蒸气发生应均匀充足。蒸馏过程中不 能停止加热断气，否则会发生倒吸现象。能停止加热断气，否则会发生倒吸现象。 加入碱液时应小心，注意安全。加碱量要加入碱液时应小心，注意安全。加碱量要 充足，动作快，冷凝器出口应浸于吸收液中，充足，动作快，冷凝器出口应浸于吸收液中， 防止氨的挥发损失。在蒸馏结束时，先将冷防止氨的挥发损失。在蒸馏结束时，先将冷 凝管的管口提离吸收液面以免发生倒吸。继凝管的管口提离吸收液面以免发生倒吸。继 续蒸馏续蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管出口，然后用少量水冲洗冷凝管出口 端外部，再取下接收瓶。在冲洗蒸馏装置时，端外部，再取下接收瓶。在冲洗蒸馏装置时， 要特

22、别注意防止碱液污染冷凝器和吸收瓶。要特别注意防止碱液污染冷凝器和吸收瓶。 凯氏定氮法适用于食品中蛋白质的测定，凯氏定氮法适用于食品中蛋白质的测定， 但不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白但不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白 质含氮物质的食品中蛋白质的测定。质含氮物质的食品中蛋白质的测定。 凯氏定氮法凯氏定氮法试样的处理：采用凯氏烧瓶，试样的处理：采用凯氏烧瓶， 使全部样品浸泡于消化液中，在通风橱中进使全部样品浸泡于消化液中，在通风橱中进 行消化。测定蛋白质时只能用硫酸消化。对行消化。测定蛋白质时只能用硫酸消化。对 于难消化的样品可加入少量过氧化氢，但不于难消化的样品可加入少量过氧化氢，但不

23、得使用高氯酸，以免生成氮氧化物。得使用高氯酸，以免生成氮氧化物。 硼酸吸收液温度较高时会影响对氨的吸收硼酸吸收液温度较高时会影响对氨的吸收 作用，应将吸收瓶置冷水浴中冷却。作用，应将吸收瓶置冷水浴中冷却。 二、二、 常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法 原理及适用范围同微量原理及适用范围同微量 法相同。法相同。 2.操作方法操作方法 1）样品消化）样品消化 准确称取均匀的固体样品准确称取均匀的固体样品0.2002.00g，或半固，或半固 体样品体样品2.005.00g，或吸取溶液样品，或吸取溶液样品10.00 25.00mL(约相当于约相当于30-40mg氮氮)。小心移入干燥洁净。小心移入干燥洁净 的

24、的500mL凯氏烧瓶中凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上勿粘附在瓶壁上)。加入。加入0.g硫硫 酸铜、酸铜、g硫酸钾及硫酸钾及2mL浓硫酸，小心摇匀后，于浓硫酸，小心摇匀后，于 瓶口放一小漏斗，瓶颈瓶口放一小漏斗，瓶颈45角倾斜置电炉上，在通角倾斜置电炉上，在通 风橱内加热消化。先以小火缓慢加热，待内容物完风橱内加热消化。先以小火缓慢加热，待内容物完 全炭化、泡沫消失后，加大火力，保持瓶内液体微全炭化、泡沫消失后，加大火力，保持瓶内液体微 沸，消化至溶液呈透明蓝绿色。继续加热沸，消化至溶液呈透明蓝绿色。继续加热0.5h，冷却，冷却 至室温。至室温。 小心加入小心加入200mL蒸馏水，待完全冷却后，加入

25、数蒸馏水，待完全冷却后，加入数 粒玻璃珠以防蒸馏时暴沸。粒玻璃珠以防蒸馏时暴沸。 仪器：仪器： 消化装置消化装置 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收 将凯氏烧瓶按蒸馏装置图连接好，塞紧瓶将凯氏烧瓶按蒸馏装置图连接好，塞紧瓶 口，冷凝管下端插入吸收瓶液面之下（瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面之下（瓶 内预先装有内预先装有50mL，40g/L硼酸溶液及混合指硼酸溶液及混合指 示剂示剂2-3滴）。滴）。 从安全漏斗中慢慢加入从安全漏斗中慢慢加入70mL，400g/L氢氧氢氧 化钠溶液，并摇动凯氏瓶，至瓶内溶液呈化钠溶液，并摇动凯氏瓶，至瓶内溶液呈 深蓝色，或产生黑色沉淀（溶液若呈蓝色深蓝色，或产生黑色沉淀（溶

26、液若呈蓝色 不生成沉淀，应再增加氢氧化钠用量），不生成沉淀，应再增加氢氧化钠用量）， 再加入再加入100mL蒸馏水，夹紧夹子，用直火加蒸馏水，夹紧夹子，用直火加 热蒸馏热蒸馏30min，至氨全部蒸出，将冷凝管下，至氨全部蒸出，将冷凝管下 端提离液面，继续蒸馏端提离液面，继续蒸馏1min，用蒸馏水淋，用蒸馏水淋 洗尖端后停止蒸馏。洗尖端后停止蒸馏。 “以奈氏试以奈氏试 剂剂”检查氨是否全部蒸完：检查氨是否全部蒸完： 奈氏试剂奈氏试剂Nessler试剂，试剂，K2（HgI4） 检验检验NHNH4 4+ +离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。 配制配制 方

27、法方法1 1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 2 溶于 溶于70 70 毫升水。加毫升水。加3030毫升毫升4 4 mol/Lmol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃 瓶中盖紧口。瓶中盖紧口。 方法方法2 2、 溶解溶解11.5 g HgI11.5 g HgI2 2 + KI 10 g + KI 10 g于适量少许水，后加水稀于适量少许水，后加水稀 释至释至50 ml,50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶

28、中。 3）滴定）滴定 将接受瓶内的硼酸液用将接受瓶内的硼酸液用0.1000mol/L盐酸标准溶液滴定盐酸标准溶液滴定 至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开 始操作完全相同）。始操作完全相同）。 3.计算计算 %100 1000 )( 21 F m M VVc 蛋白质含量 与微量法不同点：与微量法不同点： 吸收硼酸液量吸收硼酸液量：10 mL（20g/L） 50 mL （40g/L）；）； 加入氢氧化钠（加入氢氧化钠（400g/L ）量：）量： 10 mL 70 mL 滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.0500 mol/L 0.1000

29、mol/L ； 蒸馏装置：蒸馏装置： 操作方法操作方法 消化：微量法要将消化完全后的消化液定容消化：微量法要将消化完全后的消化液定容100mL 容量瓶。容量瓶。 装置的安装装置的安装 蒸馏、吸收：与微量法不同的是蒸馏、吸收：与微量法不同的是 微量法取样品定容液微量法取样品定容液10mL，1/10；常量法为所；常量法为所 有有 直接加热蒸出氨直接加热蒸出氨 注意问题：注意问题： 加碱量要足，操作要迅速，漏斗要采用加碱量要足，操作要迅速，漏斗要采用 水封防氨逸出；水封防氨逸出； 注意控制热源使蒸汽产生稳定，不能太注意控制热源使蒸汽产生稳定，不能太 猛或太弱；猛或太弱； 要注意蒸汽控制夹子的操作，以

30、防蒸汽要注意蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽 受阻爆炸或吸收液倒吸。受阻爆炸或吸收液倒吸。 三、三、 自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法 1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点：特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消分钟可消 化完毕。化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12

31、 分钟完成分钟完成1个样。个样。 北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司 产品名称：产品名称： 凯氏定氮仪凯氏定氮仪 二、分光光度法二、分光光度法 1.原理原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫 酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解， 分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸氨。在分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸氨。在 pH4.8的乙酸钠的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，氨与乙酰乙酸缓冲溶液中，氨与乙酰 丙酮和甲醛反应生成黄色的丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰二乙酰-2,6-二二 甲基甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长二

32、氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结 果乘以换算系数，即为蛋白质含量。果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2.试剂与材料试剂与材料 硫酸铜、硫酸钾、硫酸硫酸铜、硫酸钾、硫酸 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液(300g/L):称取称取30g氢氧化钠加水溶解后，氢氧化钠加水溶解后， 放冷，并稀释至放冷，并稀释至100mL。 对硝基苯酚指示剂溶液对硝基苯酚指示剂溶液(1g/L):称取称取0.1g对硝基苯酚指示对硝基苯酚指示 剂溶于剂溶于20mL95%乙醇中，加水稀释至乙醇中，加水稀释至100mL。 乙酸溶液乙酸溶液(1mol/L):量取

33、量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至冰乙酸，加水稀释至 100mL。 乙酸钠溶液乙酸钠溶液(1mol/L):称取称取41g无水乙酸钠或无水乙酸钠或68g乙酸钠乙酸钠 (CH3COONa3H2O) ，加水溶解后并稀释至，加水溶解后并稀释至500mL。 乙酸钠乙酸钠-乙酸缓冲溶液乙酸缓冲溶液:量取量取60mL乙酸钠溶液与乙酸钠溶液与40mL乙乙 酸溶液混合，该溶液酸溶液混合，该溶液PH4.8。 显色剂：显色剂：15mL甲醛与甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，乙酰丙酮混合， 加水稀释至加水稀释至100mL，剧烈振摇，混匀，剧烈振摇，混匀(室温室温 下放置稳定下放置稳定3d)。 氨氮标准贮备溶液氨氮标准贮备溶

34、液(以氮计以氮计)(1.0g/L):精密称精密称 取取105干燥干燥2h的硫酸铵的硫酸铵0.4720g，加水溶解，加水溶解 后移入后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，容量瓶中，并稀释至刻度， 混匀，此溶液每混匀，此溶液每mL相当于相当于1.0mg氨。氨。 氨氮标准使用溶液氨氮标准使用溶液 (0.1g/L):用移液管吸取用移液管吸取 10.00mL氨氮标准贮备液于氨氮标准贮备液于100mL容量瓶内，容量瓶内， 加水定容至刻度，混匀，此溶液每加水定容至刻度，混匀，此溶液每mL相当相当 于于0.1mg氮。氮。 3.仪器与设备仪器与设备 分光光度计分光光度计 电热恒温水浴锅电热恒温水浴锅 10mL

35、具塞玻璃比色管具塞玻璃比色管 4.分析步骤分析步骤 试样消解：试样消解： 称取经粉碎混匀过称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样目筛的固体试样 0.1g0.5g(精确至精确至0.001g)或半固体试样或半固体试样0.2- 1.0g或吸取液体试样或吸取液体试样1-5mL，移入干燥的，移入干燥的 100mL或或250mL定氮瓶中，加入定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、硫酸铜、 1g硫酸钾及硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小硫酸，摇匀后于瓶口放一小 漏斗，将定氮瓶以漏斗，将定氮瓶以45角斜支于有小孔的石角斜支于有小孔的石 棉网上。缓慢加热，待内容物完全炭化、泡棉网上。缓慢加热，待内容物完全炭化、泡 沫完

36、全停止后，加强火力，并保持瓶内液体沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体 微沸，至溶液呈蓝绿色澄清透明后，继续加微沸，至溶液呈蓝绿色澄清透明后，继续加 热热0.5h，取下放冷。，取下放冷。 4.分析步骤分析步骤 慢慢加入慢慢加入20mL蒸馏水，放冷后移入蒸馏水，放冷后移入50mL 或或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗 液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀备用。液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀备用。 按同一方法做试剂空白试验。按同一方法做试剂空白试验。 试样溶液的制备：试样溶液的制备： 吸取吸取2.005.00mL试样或试剂空白消化试样或试剂空白消化 液

37、于液于50mL或或100mL容量瓶内，加容量瓶内，加12滴对硝滴对硝 基苯酚指示剂，摇匀后滴加氢氧化钠溶液基苯酚指示剂，摇匀后滴加氢氧化钠溶液 中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色， 用水稀释至刻度，混匀。用水稀释至刻度，混匀。 标准曲线的绘制：标准曲线的绘制： 吸取吸取0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、 0.8和和1.0mL氨氮标准使用溶液氨氮标准使用溶液(相当于相当于0.00、 5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和和100.0g 氮氮) ，分别置于，分别置于10mL比色管中。加比色管中。加4.0mL乙乙 酸钠酸钠

38、-乙酸缓冲溶液及乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，加水稀显色剂，加水稀 释至刻度，混匀。置于释至刻度，混匀。置于100 水浴中加热水浴中加热 15min。取出用水冷却至室温后，移入。取出用水冷却至室温后，移入1cm 比色皿内，以零管为参比，于波长比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处处 测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制 标准曲线或计算线性回归方程。标准曲线或计算线性回归方程。 试样测定：试样测定： 吸取吸取0.502.00mL(约相当于氮约相当于氮100g) 试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于 10mL比色皿比

39、色皿 中。以下按标准曲线自中。以下按标准曲线自“加加 4mL乙酸钠乙酸钠-乙酸缓冲溶液乙酸缓冲溶液”起操作。试起操作。试 样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线 性回归方程求出含量。性回归方程求出含量。 5.分析结果分析结果: X:试样中蛋白质的含量，试样中蛋白质的含量，g/100g c :试样测定液中氮的含量，试样测定液中氮的含量，g c0 :试剂空白测定液中氮的含量，试剂空白测定液中氮的含量，g V1 :试样消化液定容体积，试样消化液定容体积，mL V2 :制备试样溶液的消化液体积，制备试样溶液的消化液体积，mL V3 :试样溶液总体积，试样溶液总体积，m

40、L V4 :测定用试样溶液体积，测定用试样溶液体积，mL m :试样质量，试样质量，g F :氮换算为蛋白质的系数。氮换算为蛋白质的系数。 F V V V V m cc X 100 10001000 )( 3 4 1 2 0 6.注意事项注意事项 配制试剂所用水均为无氨水。配制试剂所用水均为无氨水。 该法检出线为该法检出线为0.070 g/mL。 线性范围为线性范围为0-10.0 g/mL 三、燃烧法（杜马斯法）三、燃烧法（杜马斯法） 样品在高温下燃烧，释放的氮气由样品在高温下燃烧，释放的氮气由 带热导检测器的气相色谱仪测定。测得带热导检测器的气相色谱仪测定。测得 的氮含量转换成样品中的蛋白质

41、含量。的氮含量转换成样品中的蛋白质含量。 四、双缩脲法四、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准 确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、紫外分光光度法、 染料结合法、染料结合法、 水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。 1.原理原理 脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2加热至加热至150160时，时， 两分子缩和成双缩脲。两分子缩和成双缩脲。 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物， 这种反应叫双缩脲反应。（

42、缩二脲反应）这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键 CONH，与双缩，与双缩 脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定 条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分 光光度计来测其吸光度，确定含量。（光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm） NH2CONHCONH2 + NH3 NH2CONH2 + NH2CONH2 注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。 样品不用消化。样品不用消化。 2. 方法特点及应用范围方

43、法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化 学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于 豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3.主要仪器：主要仪器： 分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂：试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳四氯化碳 5操作方法：操作方法： 采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘 标准曲线标准曲线。 样品的测定样品的测定

44、 6.6.计算计算 7.7.注意事项注意事项 五紫外吸收法五紫外吸收法 1 1原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团， R R （ NHCHCO NHCHCO） 对紫外光有吸收作用在对紫外光有吸收作用在280 nm280 nm下，吸光度与蛋白下，吸光度与蛋白 质浓度成直线关系，求含量。质浓度成直线关系，求含量。 2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因 素多，故在食品分析领域应用不广泛。素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3 3主要仪器：主要仪器： 紫外分光光度计紫外分光光度计 离心机（离心机（3000 5000 r/min3000

45、 5000 r/min） 4 4操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线 六、福林六、福林-酚比色法酚比色法 蛋白质与福林蛋白质与福林-酚试剂反应，产生蓝色复合酚试剂反应，产生蓝色复合 物。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶物。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶 性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 七、考马斯亮蓝染料比色法七、考马斯亮蓝染料比色法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250，蛋白质染料，与蛋白质，蛋白质染料，与蛋白质 通过范德华力引力结合，使蛋白质染色，在通过范德华力引力结合，使蛋白质染色，在 620nm处有最大吸收值。

46、处有最大吸收值。 八、染料结合法八、染料结合法 蛋白质蛋白质+染料染料沉淀物沉淀物 剩余染料剩余染料 分光光度计测定分光光度计测定 九、水杨酸比色法九、水杨酸比色法 硫酸硫酸 温度酸度温度酸度 样品样品 铵盐铵盐 蓝色络合物（蓝色络合物（660nm） 消化消化 次氯酸钠次氯酸钠 十、红外光谱法十、红外光谱法 利用多肽键在中外红和近红外波段的特征利用多肽键在中外红和近红外波段的特征 吸收测定蛋白质含量。吸收测定蛋白质含量。 十一、比浊法十一、比浊法 低浓度的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙低浓度的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙 酸中的铁氰化钾能使蛋白质沉淀形成蛋白酸中的铁氰化钾能使蛋白质沉淀形成蛋白 质颗粒的

47、悬浮液，其浊度可由辐射光传送质颗粒的悬浮液，其浊度可由辐射光传送 过程中的衰减而确定，辐射光衰减的程度过程中的衰减而确定，辐射光衰减的程度 与溶液中蛋白质浓度成正比。与溶液中蛋白质浓度成正比。 第五节第五节 氨基酸的定性测定氨基酸的定性测定 利用各种显色反应。利用各种显色反应。 第六节第六节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定 一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定 （一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法 1.1.原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性 NHNH2 2 基，又有基，又有 酸性酸性 COOH COOH 基，成中性内盐，加入甲醛基，成中性内盐，加入甲醛 溶液后，甲醛与溶液后，甲醛与

48、 NHNH2 2 结合，从而使碱结合，从而使碱 性消失，再用强碱来滴定性消失，再用强碱来滴定COOH COOH 基，并用基，并用 间接的方法测定氨基酸总量。间接的方法测定氨基酸总量。 2 2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其 发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品 中游离氨基酸的测定）中游离氨基酸的测定） 3 3双指示剂：双指示剂： 40% 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示 剂，用氢氧化钠将剂，用氢氧化钠将40%40%甲醛中和至淡蓝色。甲醛中和至淡蓝色。 1g/L 1g/L百里

49、酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液， 1g/L 1g/L中性红中性红50%50%乙醇溶液，乙醇溶液， 0.1 mol/L 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。 4 4操作：吸取含操作：吸取含20-30mg20-30mg氨基酸的样品溶液氨基酸的样品溶液2 2 份，分别置于份，分别置于250mL250mL锥形瓶中，各加入锥形瓶中，各加入50mL50mL蒸蒸 馏水，馏水， 其中一份加入其中一份加入3 3滴中性红指示剂，用氢氧化滴中性红指示剂，用氢氧化 钠标准溶液滴定至终点，钠标准溶液滴定至终点，中和样液中其它酸性中和样液中其它酸性 物质。物质。 另一份样液中加入另一份样液中加入3 3

50、滴百里酚酞指示剂和中滴百里酚酞指示剂和中 性甲醛性甲醛20mL20mL，摇匀，静置，摇匀，静置1min1min，用标准，用标准NaOHNaOH滴滴 定至终点。定至终点。中和样液中氨基酸的羧基与其它酸中和样液中氨基酸的羧基与其它酸 性物质的总和。性物质的总和。 二者之差可计算氨基酸含量二者之差可计算氨基酸含量 说明：说明： 此法适用于测定食品中的游离氨基酸。此法适用于测定食品中的游离氨基酸。 固体样品应先粉碎，准确称样后用水萃取，测固体样品应先粉碎，准确称样后用水萃取，测 定萃取液，液体试样可直接测定。萃取在定萃取液，液体试样可直接测定。萃取在50水水 浴中进行浴中进行0.5h。 若样品颜色较深

51、，可加适量活性炭脱色，或用若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色，或用 电位滴定法测定。电位滴定法测定。 与本法类似的还有单指示剂与本法类似的还有单指示剂(百里酚酞百里酚酞)甲醛滴定甲醛滴定 法，此法用标准碱完全中和法，此法用标准碱完全中和COOH时的时的pH值值 为为8.59.5，但分析结果稍偏低。，但分析结果稍偏低。 （二）电位滴定法（二）电位滴定法 1.原理原理 2.试剂试剂 甲醛（甲醛（36%）：应不含有聚合物）：应不含有聚合物 氢氧化钠标准滴定溶液（氢氧化钠标准滴定溶液（0.050mol/L） 3.仪器仪器 酸度计酸度计 磁力搅拌器磁力搅拌器 10mL微量滴定管微量滴定管 4.分析步骤分

52、析步骤 吸取吸取5.0mL试样，置于试样，置于100mL容量瓶中，加入容量瓶中，加入 至刻度，混匀后吸取至刻度，混匀后吸取20.0mL，置于，置于200mL烧杯烧杯 中，加中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化水，开动磁力搅拌器，用氢氧化 钠标准溶液滴定至酸度计指示钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记下消，记下消 耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总 酸含量。酸含量。 加入加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标 准滴定溶液继续滴定至准滴定溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗氢氧，记下消耗氢氧 化钠标准滴定溶

53、液的毫升数。化钠标准滴定溶液的毫升数。 同时取同时取80mL水，先用氢氧化钠溶液调节至水，先用氢氧化钠溶液调节至pH 为为8.2，再加入，再加入10.0mL甲醛溶液，用氢氧化钠甲醛溶液，用氢氧化钠 标准滴定溶液继续滴定至标准滴定溶液继续滴定至pH9.2，同时做试剂，同时做试剂 空白试验。空白试验。 5.结果计算结果计算 X试样中氨基酸态氮的含量，试样中氨基酸态氮的含量，g/100mL V1 测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准 滴定液的体积，滴定液的体积，mL V2 试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴

54、 定液的体积，定液的体积，mL V 3试样稀释液取用量，试样稀释液取用量， mL C 氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L 0.014 与与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液相当的氮氢氧化钠标准滴定溶液相当的氮 的质量，的质量，g 计算结果保留两位有效数字计算结果保留两位有效数字 100 100 5 014. 0)( 3 21 V cVV X 适用于混浊和色深样液，终点颜色难以适用于混浊和色深样液，终点颜色难以 观察的样品。观察的样品。 （三）比色法（三）比色法 同蛋白质测定中的分光光度法同蛋白质测定中的分光光度法 （四）茚三酮的比色法（四）茚三酮的比色法 原理：

55、氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成 蓝紫色化合物，可比色定量。蓝紫色化合物，可比色定量。 GB/T5009.39-2003GB/T5009.39-2003酱油卫生标准的分析方法酱油卫生标准的分析方法 4.24.2氨基酸态氮氨基酸态氮 甲醛值法甲醛值法 比色法比色法 第七节第七节 氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（薄层层析法（一薄层色谱法（薄层层析法（TLC TLC 法）法） Thin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography 简介：简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析近年

56、来发展起来的一种微量而快速的层析 方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板 上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适 的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目 的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层 析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来 分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。 （一）原理：（一）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层取一定量经水

57、解的样品溶液，滴在制好的薄层 板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各样品各 组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等 作用，同一物质具有相同的作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不值，不同成分则有不 同的同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目 的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比， 鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以 大致确定其含量。大致确定其含量

58、。 R Rf f = a / b = a / b a b 样点样点 溶剂前沿溶剂前沿 点样原点点样原点 优点：优点： 展开时间短，一般在展开时间短，一般在20302030分钟，展开距离分钟，展开距离 通常只需通常只需10 cm10 cm，且分离效果好。，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高点样量少，灵敏度高。（比纸层析高1010010100 倍）倍） 精确到精确到0.01ug0.01ug。 也可用于大量分离也可用于大量分离500 mg500 mg，作为样品制备，作为样品制备 层析。层析。

59、 缺点：缺点：R Rf f值重现性比纸上层析差。值重现性比纸上层析差。 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、 离子交换、凝胶等。离子交换、凝胶等。 （三）操作方法：（三）操作方法： 薄层板制备薄层板制备 样品液制备样品液制备 点样：距薄板底端点样：距薄板底端2cm2cm处，用针画一标记作为处，用针画一标记作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔展开，点与点之间间隔1 12cm2cm。 a.a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再

60、点另一个点。意要等一个点干了再点另一个点。 b.b.用一小直径用一小直径3 mm 3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。板子上先挖好一个小洞穴。 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开展开：点样完了，放入密闭容器中（展开 槽），倾斜一定角度槽），倾斜一定角度10103030，下端浸入展，下端浸入展 开剂开剂1cm1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离，千万别让溶剂浸过了样点。到离 顶端一部分，取出样板、晾干、显色。顶端一部分，取出样板、晾干、显色。 a.a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的展开剂的有关情况：主要是低沸点的2 23 3种有种有 机溶剂组成的溶